论文部分内容阅读
第一部分HDE抑制MDS细胞株SKM-1增殖的实验研究目的研究白花蛇舌草总黄酮(HDE)对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株Skm-1细胞增殖的抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法采用MTT法检测HDE对Skm-1细胞株的生长抑制作用;利用Hoechst33258荧光染色法观察HDE诱导Skm-1细胞株凋亡的形态学改变;流式细胞术检测HDE诱导Skm-1细胞凋亡和周期的变化;Western blotting法检测HDE对Skm-1细胞周期和凋亡相关蛋白的调控以及Akt、P65蛋白表达的变化。结果(1)0.05-0.125 mg/ml HDE作用于Skm-1细胞株24 h抑制率分别为3.30%,15.83%,49.53%,67.93%,48 h 抑制率分别为 4.10%,11.30%,58.47%,80.60%,IC50分别是 1.8 mg/ml、0.8 mg/ml。(2)用浓度为 0.05-0.1 mg/ml 的 HDE 处理 Skm-1 细胞,24小时后收集细胞进行hoechst33258染色,Skm-1细胞核内可见明显的凋亡小体,并且随着HDE浓度的增加凋亡小体逐渐增多。(3)浓度为0、0.075、0.1、0.125 mg/ml的HDE分别作用于Skm-1细胞株,24小时后行AV-PI流式细胞术检测,早期凋亡率分别是 4.49%,7.28%,9.37%,18.1%.用浓度为 0、0.075、0.1、0.125 mg/ml 的 HDE 分别作用于Skm-1细胞株,24小时后流式细胞术检测周期周期数据,对照组细胞G0/G1期比率为34.89%,0.075 mg/ml的HDE处理细胞后,G0/G1期细胞比率增至41.53%,0.1mg/ml的HDE处理细胞后,G0/G1期细胞比率增至48.02%。(4)Western blotting结果显示使细胞周期相关蛋白CDK4、CDK6、CyclinD1相关蛋白表达下调。(5)HDE能显著上调凋亡相关蛋白Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3和PRAP表达,并呈剂量依赖性。(6)HDE作用于Skm-1细胞株后能显著上调Cytc、Bak,下调Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、XIAP1 CIAP1,CIAP-2,但对Bax、Bid表达无明显影响。(7)HDE显著抑制BP3K、磷酸化Akt(p-Akt)表达,对总Akt也有抑制作用,此外,HDE也抑制P65和PP65蛋白表达。结论(1)在一定浓度范围内的HDE(0.05-0.125 mg/ml)可明显抑制Skm-1细胞株的增殖,有较好的浓度依赖性。(2)HDE可诱导Skm-1细胞株凋亡和细胞周期阻滞,其机理是通过影响Bcl-2家族蛋白Bcl-2,Mcl-1,Bcl-xl以及抑制IAPs家族的表达导致线粒体损伤使得Caspase-9,Caspase-3激活诱导凋亡,可能与死亡受体通路也有一定的关系。(3)HDE通过抑制周期蛋白引起凋亡(4)HDE通过引起抑制PI3K/Akt信号通路及NF-κ B信号通路诱导细胞凋亡。第二部分:热休克蛋白90抑制剂BIIB021对Skm-1细胞增殖抑制的实验研究目的:研究热休克蛋白90抑制剂BIIB021对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株Skm-1细胞增殖的抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测BIIB021对Skm-1细胞株的生长抑制作用;利用Hoechst33258荧光染色法观察BIIB021诱导Skm-1细胞株凋亡的形态学改变;流式细胞术检测BIIB021诱导Skm-1细胞凋亡和周期的变化;Western blot法检测BIIB021对Skm-1细胞周期和凋亡相关蛋白的调控以及Akt、p65等蛋白表达的变化。结果:(1)50-400 nmol/L BIIB021作用于Skm-1细胞株24 h抑制率分别为5.10%、16.20%、38.40%、54.30%,、48 h 抑制率分别为 14.60%、28.70%、60.00%、79.40%,IC50分别是 355.69nmol/L,168.6nmol/L。(2)用浓度为 100、200、400 nmol/L 的 BIIBO21处理Skm-1细胞,24小时后收集细胞进行hoechst33258染色,Skm-1细胞核内可见明显的凋亡小体,并且随着HDE浓度的增加凋亡小体逐渐增多。(3)浓度为0、100、200、400 nmol/L的BIIB021分别作用于Skm-1细胞株,24小时后行AV-PI流式细胞术检测,早期凋亡率分别是 3.95%、9.30%、14.50%、24.30%。用浓度为 0、100、200、400 nmol/L的BIIB021分别作用于Skm-1细胞株,24小时后流式细胞术检测周期数据结果显示:对照组细胞G0/G1期比率为34.94%,100 nM的BIIB021处理细胞后,G0/G1期细胞比率增至40.52%,200nM的BIIB021处理细胞后,G0/G1期细胞比率增至42.91%。(4)Western blotting结果显示BIIB021作用后激活Caspase-8、-3和PARP,下调周期蛋白CDK4/6、CyclinDl,并能明显抑制PI3K、Akt、P-Akt、P65、PP65蛋白表达。结论:(1)在一定浓度范围内的BI1BO021(50-400 nmol/L)可明显抑制Skm-1细胞株的增殖,有较好的浓度依赖性。(2)BIIBO21可诱导Skm-1细胞株凋亡和细胞周期阻滞,其凋亡机理与其激活Caspasc-3、PARP、Caspase-8蛋白和阻滞周期相关蛋白表达有关,并通过影响PI3K/Akt及NF-κ B通路。第三部分HDE联合BIIB021抑制Skm-1细胞株增殖的实验研究目的:研究白花蛇舌草总黄酮(HDE)联合热休克蛋白90抑制剂(BIIB021)对骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株Skm-1细胞增殖的抑制作用,并进一步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测HDE联合BIIB021对Skm-1细胞株的增殖抑制作用;利用Hoechst33258荧光染色法观察HDE联合BIIB021诱导Skm-1细胞株凋亡的形态学改变;采用流式细胞术检测HDE联合BIIB021诱导Skm-1细胞凋亡和周期的情况;Western blotting法检测HDE联合BIIB021对Skm-1细胞周期和凋亡相关蛋白的调控以及PI3K,Akt等蛋白表达的变化。结果:(1)与对照组比较,BIIB021组联合低剂量HDE组(0.075 mg/ml)对细胞增殖活力的影响,有统计学意义(P<0.05),随着HDE浓度的升高,对Skm-1细胞抑制作用逐渐增强,低剂量HDE组(0.075 mg/ml)与高剂量HDE组(0.1 mg/ml)比较有统计学意义(P<0.05);(2)Hoechst33258荧光染色观察到联合组比单药组细胞凋亡更明显;(3)流式细胞术凋亡分析结果显示:对照组早期凋亡率为4.35%,低剂量HDE(0.075 mg/ml)处理后,早期凋亡率为8.25%,100 nM BIIB021处理后,早期凋亡率为13.7%,低剂量HDE(0.075 mg/ml)与100 nM BIIB021联合后早期凋亡率为21.1%(3)流式细胞术周期分析结果显示:对照组G1期细胞比例为:37.8%,低剂量HDE组(0.075 mg/ml)G1期细胞比例为43.1%,100 nM BIIB021组G1期细胞比例为43.1%,低剂量HDE(0.075 mg/ml)与100 nM BIIB021联合后G1期细胞比例为:93.1%,阻滞比单药作用时更加明显。(4)HDE 联合 BIIB021 诱导 Skm-1 细胞株凋亡时,Caspase-8、Caspase-3、PARP比单药作用明显激活,周期蛋白CDK4、CDK6、CyclinD1、并能下调PI3K、Akt、P-Akt、P65、PP65蛋白表达。结论:HDE对BIIB021抑制Skm-1细胞株增殖有增敏作用,其作用机制可能与PI3K/Akt和NF-κ B信号通路激活有关。