研究背景:本课题组前期以苯并噁唑酮为母环,设计合成了一系列4位取代衍生物,经过活性初步筛选发现,4-邻甲基苯磺酰氧基-苯并噁唑酮（MBB）、3-（2-苯基）乙基-4-（2-苯基）氧基苯并噁唑-2-酮（W6I）、4-5’-二甲氨基萘-1’-磺酰氧基-苯并噁唑酮（W3D）具有较好的抗炎活性,但此类化合物作用机制及靶点尚不明确。目的:本论文旨在通过建立LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）炎症模型进一步评价此类化合物的抗炎活性,并初步探讨优选化合物的抗炎作用机制和靶点。方法:第一部分4-取代苯并噁唑酮类衍生物抗炎活性研究1.MTT法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对RAW264.7细胞活力的影响。2.Griess法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响。ELISA法测定4-取代苯并噁唑酮类衍生物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2的影响。3.二甲苯致小鼠耳肿胀法研究4-取代苯并噁唑酮类衍生物体内抗炎活性。第二部分化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的调控作用1.Western blot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、MyD88、p-IRAK4和细胞胞浆胞核NF-κB蛋白表达的影响。2.Western blot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞p-P38和p-ERK蛋白表达的影响。3.Western blot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞IL-6、iNOS蛋白表达的影响。4.荧光定量PCR法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4、MyD88、NF-κB的影响。第三部分化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性靶点的初探1.Western blot法检测4-取代苯并恶唑酮类衍生物W3G、MBB、W3E、W3A、W6I、W3D对TLR4、p-NF-κB蛋白表达的影响。2.流式细胞术检测化合物W3D对FITC-LPS结合细胞膜表面受体的竞争性抑制作用。3.TLR4阻断剂TAK242作用RAW264.7细胞后,LPS与W3D共同处理细胞,Griess法测定细胞上清液中NO释放量;Elisa法测定IL-1β、IL-6、TNF-α。Western blot法测定化合物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4、p-IRAK4、p-NF-κB蛋白表达的影响。第四部分化合物W3D作用于LPS诱导的RAW264.7细胞的RNA-seq测序研究1.采用RNA-seq转录组学,在mRNA水平上筛选化合物W3D作用于LPS诱导的RAW264.7细胞前后差异表达基因,并对其进行生物信息学分析。2.荧光实时定量PCR法验证相关差异基因。结果:1.化合物W3D、W6I、MBB在0-100μmol·L^-1浓度下对RAW264.7细胞无明显毒性（p<0.01）;在此剂量范围内,化合物W3D、W6I、MBB可剂量依赖性的显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞培养上清液中NO、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,可抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀;其中化合物W3D对炎症因子的抑制作用最为显著,在同等剂量(25μmol·L^-1),其对IL-6的抑制作用强于阳性药物塞莱昔布。对二甲苯所致小鼠耳肿胀抑制率与同等剂量(25mg·kg^-1)的阳性药物塞莱昔布相当。2.化合物W3D可以在蛋白水平上抑制TLR4、MyD88的表达（p<0.01）,抑制IRAK4、P38、ERK磷酸化以及NF-κB的入核活化,并且对炎症效应蛋白IL-6、iNOS的表达有显著的抑制作用（p<0.01）,呈现一定的剂量依赖性。在转录水平上可显著抑制TLR4、MyD88 mRNA的表达（p<0.01）,但对NF-κB mRNA表达并无抑制作用。3.4-取代苯并恶唑酮衍生物W3G、MBB、W3E、W3A、W6I、W3D对TLR4、p-NF-κB蛋白表达有不同程度的抑制作用。4.流式细胞术受体竞争性抑制实验结果表明,化合物W3D可以抑制FITC-LPS与RAW264.7细胞膜上TLR4受体的结合。5.TLR4特异性阻断剂可部分抵消化合物W3D对NO、IL-1β、IL-6、TNF-α、释放的抑制,也可部分抵消化合物W3D对TLR4蛋白的表达和IRAK4、NF-κB蛋白的磷酸化激活。6.RNA-seq转录组学结果表明,与LPS造模组相比,化合物W3D(25μmol·L^-1)组上调基因8650个,下调差异基因9253个,GO功能分析结果表明,这些差异基因影响细胞凋亡、细胞代谢、细胞免疫应激、细胞代谢等重要的反应过程;差异基因pathway分析结果表明,在mRNA水平上,化合物W3D对RAW264.7细胞可通过调控多种信号通路发挥抗炎作用,其中主要有MAPK信号通路、TNF-α信号通路、Toll样受体信号通路等。结论:1.新型苯并噁唑酮类衍生物W3D对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症有显著的抑制作用,且对二甲苯所致的小鼠耳肿胀炎症有较好的体内抑制活性。2.新型苯并噁唑酮衍生物W3D对TLR4-MyD88-MAPK-NF-κB信号通路具有调控作用。3.新型苯并噁唑酮衍生物W3D可显著抑制LPS与膜受体TLR4的结合;其对TLR4-NF-κB信号通路的调控作用与TLR4抑制剂TAK242具有协同作用;该类化合物对TLR4的抑制活性具有明显的构效关系,以上实验结果提示TLR4可能为化合物W3D发挥抗炎活性的作用靶标。