家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori L.Nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)病是对蚕业生产危害最为严重的一类传染性疾病,每年由此病给蚕茧造成的损失,大约占蚕病损失的70%左右。但是到目前为止,家蚕抗BmNPV病作用机制仍不明晰。本研究利用本课题组育成的对BmNPV高度抗性的品种为素材,对其经BmNPV侵染后进行组织形态学和组织切片观察,并利用RNA-seq技术对抗性素材和常规品种的脂肪体组织进行转录组分析,获得可能涉及抗性机制的差异基因,同时,我们筛选出一段长1512bp的cDNA序列,属于家蚕海藻糖辅酶基因家族。荧光定量PCR检测该基因在抗性品种秋丰N脂肪体和中肠组织中表达水平明显上调,初步推测家蚕海藻糖辅酶与家蚕对BmNPV的抗性存在一定关联。主要研究结果如下:1、家蚕组织形态学观察和组织切片观察为探究BmNPV侵染家蚕后其组织在形态学上的变化,选用抗性品种秋丰N和常规品种秋丰两个家蚕品种进行试验。结果显示:家蚕经口添BmNPV60h后常规品种秋丰血液与抗性品种秋丰N相比,开始出现浑浊状,说明病毒增殖显著。中肠组织在添食60h左右与对照组比起来颜色略深,在84h之后出现糜烂、萎缩的状态。经皮下穿刺BmNPV48h左右家蚕血液与对照组比开始出现浑浊状,在60h浑浊比较明显说明病毒增殖接近平台期,中肠组织在72h左右与对照组比较开始出现泛黄、糜烂,在96h之后萎缩发黑,而抗性品种秋丰N,各相对应时间点均未观察到明显的病变,无论中肠、血液,形态观察良好,没有出现Bm NPV侵染后在常规素材中的性状。我们推测,抗性品种中存在的某种抗性或清除机制导致了抗性品种对BmNPV的高度抵抗性。2、BmNPV侵染家蚕抗性和非抗性品种后脂肪体组织的转录组分析利用RNA-Seq技术对秋丰和秋丰N转录组数据进行分析。从2个获得的文库中获得14.78Gb高质量数据(在秋丰和秋丰N中分别超7.15Gb)。与参考基因组(www.silkdb.org)比对,在家蚕秋丰品种中共检测到78408个SNPs,在秋丰N品种中检测到56786个SNPs。同时,在2个品种中均发现特异RNA选择性剪接事件。BmNPV侵染48h后,秋丰N与秋丰品种比起来脂肪体有1728个差异表达基因(242个表达上调和1540个表达下调)。GO分类分析表明这些差异表达基因主要与细胞膜、新陈代谢、细胞结合和催化活性、细胞组分等过程相关。KEGG注释通路分析表明,在氧化磷酸化、吞噬体、三羧酸循环、精氨酸、脯氨酸代谢丙酮酸代谢过程中,发现较高水平的基因表达。同时,COG分析表明差异表达基因涉及到“氨基酸运输和代谢”和“信号转导机制”。在一些功能分类中我们鉴定出了大量的差异表达基因,这表明家蚕在被感染后出现一系列主要的病理变化和一些与抗病机制有关的功能。氧化应激可能与家蚕抗BmNPV感染相关。另外,诸如氧化磷酸化等许多代谢活动都对家蚕抗性机制起到作用。此外,需要了解这些单一通路差异表达基因的生理功能对进一步研究其特性以及确定其在免疫过程中所起的作用。这些发现提供了新的研究方向,将在分子水平加深我们对病毒抗性机制的认识。3、家蚕抗BmNPV抗性基因的筛选用抗性品种秋丰N和常规品种秋丰的中肠和脂肪体组织,克隆了一条长为1512bp的cDNA序列,比对之后发现其属于家蚕海藻糖辅酶基因家族的tret基因,该基因共编码504个氨基酸。该基因编码的蛋白质质量为120.456KD,等电点为7.89。荧光定量PCR检测该基因在抗性家蚕幼虫的脂肪体、中肠、血液中均有表达。在幼虫的各个组织中,以中肠和血液中的表达量最高,脂肪体次之。研究结果显示,家蚕幼虫被Bm NPV感染后24~48 h,抗性品种秋丰N脂肪体和中肠组织中tret基因的表达水平明显上调,而常规品种秋丰中变化不显著,初步推测家蚕海藻糖辅酶与家蚕对BmNPV的抗性存在一定关联。