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抗菌肽具有广谱的杀菌活性、对哺乳动物没有毒性、自身不易引发耐药性等特性,使其成为研发一种新型抗生素最好的资源之一。Cecropin是一种抗菌肽。Lectin能起到抗菌和消炎的作用,并且和抗菌肽都被定性为免疫因子。家蝇(Musca domestica L)普遍存在并且携带至少100种人类和动物疾病,然而他们能快速繁殖生长且自身不会引起疾病感染,所以家蝇必定具有完善而高效的免疫防御机制,是人们研究天然抗炎物质的重要资源。试验旨在研究家蝇cecropin-A2(Mdc-A2)和lectin subunit alpha(Lsa)蛋白在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激下的炎性反应。1)家蝇Mdc-A2蛋白在S.aureus刺激下的炎性反应。扩增Mdc-A2基因,构建在pLEX载体上,通过慢病毒转染的方法,将构建好的载体pLEXMdc-A2及pLEX分别转染到RAW264.7细胞中,通过筛选,获得稳定表达的RAW-Mdc-A2及RAW-pLEX细胞系,其中RAW-pLEX细胞作为阴性对照。通过S.aureus刺激细胞后,收集未刺激和刺激后3 h,6 h,12 h和24 h的细胞,且收集未刺激和刺激6 h细胞的上清液。提取细胞中的RNA,通过实时定量PCR(Real-Time PCR)的方法检测细胞中TNF-α,IL-1β,NFκB-1和NFκB-2的mRNA相对转录水平;通过Lipoteichoic acid(LTA)刺激细胞后,收集未刺激和刺激后6 h的细胞及其细胞的上清液,提取RNA,通过Real-Time PCR的方法检测TNF-α、NF-κB-1和NF-κB-2的mRNA相对转录水平;TNF-α蛋白水平的表达通过酶联免疫吸附测定(ELISA)。通过菌落计数计算每毫升细胞的上清液中的细菌数量。Western blotting分析表明,Mdc-A2在RAW264.7细胞中稳定表达。Real-Time PCR结果表明,在S.aureus刺激后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-Mdc-A2细胞中TNF-α的两个转录剪接体的相对转录水平,TNF-α-tv-1在6 h和12 h显著下调(P<0.05),TNF-α-tv-2在3h,6 h和12 h显著下调(P<0.05);RAW-Mdc-A2细胞中L-1β的两个转录剪接体的相对转录水平,IL-1βT在3 h,6 h和12 h显著下调(P<0.05),IL-1β在3 h和6 h显著下调(P<0.05)。在S.aureus刺激6 h后,RAW-Mdc-A2细胞的上清液中,ELISA检测和菌落计数表明,TNF-α的转录和生产水平及其上清中的细菌数量均显著下调(P<0.05)。在LTA刺激6 h后,TNF-α的转录和生产水平同样显著下调(P<0.05)。在S.aureus刺激后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-Mdc-A2细胞中NFκB-1基因的相对转录水平在3 h,6 h和12 h显著下调(P<0.05),NFκB-2基因的相对转录水平在6 h显著下调(P<0.05)。在LTA刺激6 h后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-Mdc-A2细胞中NFκB-1基因的相对转录水平显著下调(P<0.05)。2)家蝇Lsa蛋白在S.aureus刺激下的炎性反应。通过慢病毒转染的方法,将构建好的载体pLEX-Lsa及pLEX分别转染到RAW264.7细胞中,通过筛选,获得稳定表达的RAW-pLEX-Lsa及RAW-pLEX细胞系,其中RAW-pLEX细胞作为阴性对照。然后通过S.aureus刺激细胞,收集未刺激和刺激后3 h,6 h,12 h和24h的细胞,且收集未刺激和刺激6 h细胞的上清液。提取RNA,通过Real-Time PCR检测炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,NFκB-1和NFκB-2基因的相对转录水平。通过ELISA试剂盒检测细胞的上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白水平。Real-Time PCR结果显示,在S.aureus刺激后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-pLEX-Lsa细胞中TNF-α的两个转录剪接体的相对转录水平,TNF-α-tv-1在6 h显著下调(P<0.05),TNF-α-tv-2在6 h和12 h显著下调(P<0.05);RAW-pLEX-Lsa细胞中IL-1β的两个转录剪接体的相对转录水平,IL-1βT在3 h,6 h和12h显著下调(P<0.05),IL-1β在3 h和6 h显著下调(P<0.05);RAW-pLEX-Lsa细胞中NFκB-1和NFκB-2基因的相对转录水平无明显下降趋势。ELISA检测结果显示,在S.aureus刺激6h后,与RAW-pLEX细胞相比,RAW-pLEX-Lsa细胞的上清液中,TNF-α的蛋白水平显著下调(P<0.05)。结论1)家蝇Mdc-A2蛋白拥有有效地抗菌和抗炎活性。Mdc-A2通过抑制NFκB信号通路的活性进而发挥抗炎活性。2)家蝇Lsa蛋白可以有效地发挥抗炎活性,显著地抑制TNF-α和IL-1β的转录和生产,而TNF-α和IL-1β的转录和生产的下调并不是通过抑制NFκB信号通路的活性引起的。