研究背景核放射物质与核辐射技术在人们社会生活中的应用越来广泛,但意外曝露于核辐射中或接触放射性物质,对人们的造成的危害也是巨大的。在医学治疗手段中放化疗可使患者的造血系统发生严重损害。造血干细胞对辐射尤为敏感,放射剂量为（0.7-10Gy）累及造血系统^[1]造成骨髓型急性放射病（Acute radiation sickness,ARS）,主要表现为贫血、出血、感染,甚至死亡。轻中度骨髓型ARS可门诊随访、使用细胞因子、输血输液等治疗可缓解达到治愈。重度及极重度骨髓型ARS致死率极高,造血干细胞移植是治疗重度及极重度骨髓型ARS的重要选择。但选择供者及处理移植物抗宿主病（Graft versus host disease,GVHD）等对重度及极重度骨髓型ARS患者的治疗是不利的。及时降低或修复放射对人体造血系统的损伤,提高患者生存率,在治疗过程中尤为重要。造血微环境主要由骨髓中邻近造血干细胞的支持细胞（成骨细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞及间充质干细胞等）构成^[2-3],参与造血干细胞的自我更新、增殖和分化。研究表明:放射不仅对造血干细胞（HSCs,Hematopoietic stem cells）产生损伤,对HSCs赖以生存的造血微环境也造成一定影响^[4]。目的脐血造血干细胞主要应用于恶性及非恶性血液系统疾病。脐血造血干细胞可以促进放射后造血干祖细胞的增殖分化,修复放射后骨髓造血微环境,本研究的目的探究人脐血造血干细胞在放射后造血系统损伤的小鼠模型中治疗效果。方法选取清洁的C57BL/6雄性小鼠54只,通过直线加速器照射,建立辐射损伤模型。随机分为放射未治疗组（A组）、放射脐血治疗组（B组）及放射脐血治疗加强组（C组）,B组在放射后12 h后通过尾静脉注射方式输注脐血造血干细胞（输注剂量5.52-6.07×10⁶/kg）,C组小鼠分别在TBI后12h、24h进行脐血造血干细胞输注（每次输注剂量5.52-6,07×10⁶/kg）。观察TBI后各组小鼠的存活率及观察有无脱毛、弓背、腹泻等放射损伤症状,通过病理学检查评估脐血造血干细胞治疗放射对脾脏、小肠、皮肤及骨髓损伤后的效果。同时对各组小鼠放射后在第1、3、7、11、14、17、21、28d检测外周血细胞计数分析,体外培养各组小鼠骨髓单个核细胞并计数,采用流式细胞术检测骨髓单个核中CD34+细胞的比例,并用CFU-GM克隆实验检测造血祖细胞短期的增殖能力。同时同时进行体外培养骨髓间充质干细胞,分别用油红o和茜素红s染色,并用实时定量PCR测定OCN、ALP、RUNX2、PPAR、CEBP-α以检测骨髓间充质干细胞向成骨细胞及脂肪分化的能力。使用流式细胞术分析骨髓中CD68、IL-10标记的巨噬细胞表型变化,用ELISA法检骨髓中白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）的浓度变化,同时使用ELISA法分析骨髓微环境中粒-单细胞集落刺激因子（G-CSF）、干细胞因子（SCF）的表达。结果1、实验发现在放射后输注脐血造血干细胞显著升高小鼠的放射诱导的生存率:A的小鼠28d的存活率为0%,B组小鼠的存活率78%,而C组的存活率为90%,对比三组小鼠的存活率,具有统计学意义（P<0.05）。在TBI后A组小鼠的体重持续下降,第17d死亡时平均体重（11.21±0.24g）。B、C两组在TBI后第11d达到最低值分别为（14.75±0.27）g、（14.93±0.26）g,两者对比无统计学意义（P>0.05）。TBI后第3d,三组小鼠均出现脱毛,暴躁易攻击、弓背等症状。A组小鼠症状持续加重,因腹泻等原因死亡。B、C两组小鼠在第21d基本恢复正常,但仍有脱毛等症状。2、组织病理图片可示:第A组小鼠皮肤病理切片可见基底层细胞大量变性坏死,小肠黏膜结构坏死,结构完全消失,可见大量炎性细胞浸润,脾脏病理切片仅可见皮质,未见髓质及其他结构。B组小鼠皮肤可见基底层轻度增生,小肠部分可见肠绒毛纤维素样坏死,脾脏部分髓质分布不均匀。C组小鼠皮肤仅见少量细胞坏死,可见肠绒毛结构相对完整。,脾脏可见髓质分布均匀。取小鼠胸骨进行病理切片,A组小鼠骨髓腔内造血细胞明显减少,纤维化结构增多。B组小鼠骨髓腔内造血部分减少,可见恢复趋势。而C组小鼠可见幼稚红细胞及粒细胞再生。三者可见显著性对比。3、TBI后A、B、C三组小鼠外周血检测:白细胞计数在7d降至最低,三者进行对比具有统计学意义P<0.05。第28d检测B组为（9.12±1.22）×10¹²/L,C组为（10.14±1.31）×10^12/L,两组对比差异有统计学意义（P<0.05）。血红蛋白计数在第14d降至最低,A、B、C组分别为（54.00±1.42）g/L、（70.67±4.50）g/L、（98.66±2.08）g/L,三组两两对比（P<0.01、P<0.01、P<0.05）。B、C两组小鼠血红蛋白计数在21d,两组对比P<0.05,具有统计学意义。对比A、B、C三组小鼠血小板计数,差异有统计学意义（P<0.05）,在第14天达到最低点,A、B、C组小鼠血小板计数最低值分别为（56.00±4.25）×10¹²/L、（141.33±22.36）×10¹²/L、（207.33±12.10）×10¹²/L。三组对比差异有统计学意义（P<0.05）。随后B、C两组在第28d基本恢复正常对比P>0.05。4、骨髓造血干/祖细胞的检测:检测骨髓单个核细胞计数,A、B、C三组进行两两对比差异均有统计学意义（P<0.01）,而对比7d、14d,三组小鼠骨髓单个核细胞的数量均有增长,但A组小鼠增长缓慢,两个时间点的计数不具有统计学意义（P>0.05）;B、C两组增长较快具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）。在TBI后第7d,FCM检测CD34⁺细胞在骨髓单个核中所占的比例。A、B、C三组小鼠CD34⁺细胞在BM-MSNs中所占比例分别为0.57%、1.56%、1.90%,三者进行对比有显著差异,具有统计学意义（P<0.05）。在7d、14d,三组CFU-GM分别进行对比,差异具有显著差异（P<0.05,P<0.05）。5、TBI后第7、14d,A组小鼠BM-MSCs中的OCN、ALP、RUNX2基因表达水平分别为:（1.22±0.06）、（1.66±0.08）、（1.39±0.04）均低于B、C组两组小鼠BM-MSCs,差异有显著性意义（P<0.05）,C组小鼠BM-MSCs中OCN、ALP、RUNX2基因表达水平分别为（1.61±0.05）、（3.12±0.16）、（2.71±0.09）与B组小鼠BM-MSCs中OCN基因表达水平（1.44±0.07）、ALP（2.72±0.10）、RUNX2（2.61±0.33）相比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。茜素红染色后倒置显微镜下观察,A组小鼠BM-MSCs可见散在的橘红色矿化结节,而B、C组小鼠BM-MSC中橘黄色矿化结节呈片状分布,第14d,A组小鼠BM-MSC成骨矿化较差,只在部分细胞聚集处有红染现象。B、C两组可见较多均匀的红染矿化结节,未见明显差异。A组小鼠PPAR、CEBP-α基因的表达均高于B、C组中的表达,差异具有统计学意义（P<0.05）。7d、14d两个时间点对比,三组均具有统计学意义。油红O染色结果显示:7d,A组散布着橙红色的脂滴颗粒,B、C组可见散布较为均匀的脂滴颗粒,但C组较B组脂肪油滴数量减少。在14d,A组中红色脂肪油滴成簇状,几乎占满整个视野。B、C两组中的脂肪油滴差异较小,但对比第7d明显减少。6、分离提取BM中巨噬细胞,通过FCM检测第7、14d巨噬细胞中CD68、IL-10的表达。在相同的时间点,A、B、C三组的小鼠骨髓CD68的表达量进行对比差异具有统计学意义（P<0.05）。在相同的时间点,A、B、C三组的小鼠骨髓IL-10的表达量进行对比差异具有统计学意义（P<0.05）,三组小鼠IL-10的表达两两组分别进行相比较有统计学差异（P<0.01）。对比第7d、14d,三组均有所上升,对比三组的升高率差异具有统计学意义（P<0.05）。用ELISA法进行检测骨髓中IL-4的浓度,在相同时间点,A、B、C三组进行对比P<0.05具有统计学意义。ELISA检测骨髓中IFN-γ的浓度值,对比三组小鼠IFN-γ的变化值P<0.05。7、ELISA法检测骨髓细胞中G-CSF及SCF浓度变化值。相同时间点对比小鼠骨髓中G-CSF浓度,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组小鼠骨髓中SCF的浓度值的变化P<0.05,具有统计学意义。结论一、通过输注脐血造血干细胞可以改善TBI后小鼠腹泻、脱毛等辐射损伤症状,提高辐射后小鼠的生存率。二、病理组织切片可示:脐血造血干细胞可以改善TBI后小鼠皮肤、小肠及脾脏等组织的损伤程度。三、通过实验提示脐血造血干细胞的输注使TBI后小鼠骨髓单个核细胞计数明显增多,骨髓单个核细胞中CD34+细胞的比例升高,CFU-GM结果说明脐血造血干细胞促进造血干祖细胞的增殖分化,从而加快造血系统的恢复。四、TBI后输注脐血造血干细胞可以提高BM-MSCs向成骨转化能力,降低其诱导成脂能力,加快造血干细胞归巢,促进造血系统的恢复。五、脐血造血干细胞减少TBI后骨髓巨噬细胞促炎性因子IFN-γ的释放,增加抗炎因子IL-4的释放,增强骨髓巨噬细胞对造血系统的双向调节作用,降低炎性因子对血细胞生成的影响。同时上调TBI后G-CSF及SFC的浓度,促进早期造血恢复,从而缓解TBI对骨髓造血微环境的破坏。