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研究目的:探讨内质网应激在腺苷(adenosine, ADO)诱导人肝癌HepG2细胞凋亡中的作用及其分子机制。材料和方法:人肝癌HepG2细胞培养后按以下方法进行实验,①MTT法:先将细胞传代至96孔板中,待细胞贴壁后分别用含不同浓度ADO(0—6.0 mmol/L)的培养基处理HepG2细胞36 h,然后利用四氮唑蓝检测法(3-(4, 5-dimetrylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)测定ADO对HepG2细胞生长增殖的影响。②细胞核DAPI染色:先将细胞传代至盖玻片上,待细胞贴壁后将HepG2细胞暴露于不同浓度的ADO(0—4.0 mmol/L)作用36 h或2.0 mmol/L ADO作用不同时间(0—48 h),DAPI染核观察细胞核的形态学改变。③免疫荧光:先将细胞传代至盖玻片上,待细胞贴壁后加入正常培养基(空白组和对照组)或含2.0 mmol/L ADO培养基(ADO处理组)处理细胞36 h,免疫荧光观察2.0 mmol/L ADO作用前后Caspase-3和CHOP的亚细胞定位的变化。④免疫印迹法:细胞传代至培养瓶,24 h后分别加入含不同浓度ADO(0—4.0 mmol/L)的培养基处理36 h,提取细胞总蛋白质,Western blot检测细胞内质网应激相关蛋白(GRP78 , Caspase-4,CHOP,JNK)及凋亡执行者Caspase-3分子的表达情况。结果:1、MTT结果显示,随着ADO的浓度增加,ADO处理组吸光值(OD值)减少,与对照组相比,有显著性差异(p<0.05)。2、DAPI细胞核染色结果表明,1.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞36 h或2.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞12 h,细胞核出现凝聚;2.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞36 h,细胞核出现碎裂;而4.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞36 h或2.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞48 h细胞核大部出现分解。3、免疫荧光结果提示,2.0 mmol/L ADO处理HepG2细胞36 h后,Caspase-3和CHOP总体表达增加,并从胞浆易位进入胞核内。4、Western bolt实验结果表明,与对照组相比,不同浓度的ADO(0—4.0 mmol/L)处理HepG2细胞36 h后,内质网应激相关蛋白GRP78、Caspase-4、CHOP的表达随着ADO浓度的升高而增加并呈现剂量依赖性,与对照组相比均有统计学意义(p<0.05),而JNK的表达则没有明显变化;凋亡执行caspase分子Caspase-3的表达也随着ADO的增加而增加,并在2.0 mmol/L浓度达高峰,ADO处理组与对照组相比有统计学意义(p<0.05),2.0 mmol/L ADO处理组与4.0 mmol/L ADO处理组相比亦有统计学意义(p<0.05)。结论:1、腺苷能诱导人肝癌HepG2细胞凋亡,与我们既往的研究结果一致。2、在腺苷诱导HepG2细胞凋亡过程中,内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、Caspase-4的表达明显升高,CHOP和Caspase-3从胞浆转移进入胞核内,表明内质网应激通路被活化,此凋亡与内质网应激途径有关。