背景中医药治疗小儿肺炎喘嗽具有一定优势。汪受传教授治疗肺炎喘嗽,效果较显著,且安全性高、副作用少。因此,需要全面深入挖掘汪教授治疗肺炎喘嗽的用药规律。目的利用聚类和关联规则分析方法挖掘汪教授治疗儿童肺炎喘嗽的用药规律。方法以汪教授门诊治疗肺炎喘嗽的249份病案为基础,通过使用SPSS 19.0和Clementine 12.0软件对29味高频药物进行聚类和关联规则分析,探究其用药规律。结果1.聚类分析共分4个类别。C1:炙麻黄、苦杏仁、黄芩、虎杖、葶苈子、苏子及前胡;C2:桑叶、桑白皮、胆南星、枇杷叶、辛夷及重楼;C3:桔梗、枳壳、浙贝母、地龙、蝉蜕、瓜蒌、紫苑、百部、生石膏及丹参;C4:炙黄芪、白术、防风、煅龙骨、煅牡蛎。2.关联规则分析:从两药关联来看,前胡与炙麻黄、炙麻黄与杏仁、桑叶与桑白皮、前胡与杏仁、苏子与葶苈子、苏子与前胡、前胡与黄芩、虎杖与黄芩、胆南星与黄岑、胆南星与前胡、桑白皮与黄芩等两位常用药物组合;从三药关联来看,基本体现出治疗肺炎喘嗽当以宣肃肺气,清热化痰为治疗大法。宣肺类代表药物为炙麻黄、桑叶,肃降肺气类代表药物为杏仁、桑白皮、枇杷叶、前胡、葶苈子、苏子等,清肺泻热类代表药物为黄芩、虎杖等,化痰类代表药物为胆南星、杏仁等。结论运用聚类分析和关联规则分析可以初步揭示汪教授临证治疗肺炎的用药规律,即以炙麻黄、苦杏仁、桑叶、桑白皮、黄芩、虎杖、葶苈子、苏子、胆南星、前胡等为核心药物,配伍桔梗、枳壳、浙贝母、瓜萎、紫菀、百部、生石膏等清热化痰,肃肺止咳。背景肺炎是儿科常见的呼吸系统疾病,严重危害儿童健康,世界卫生组织将其列为全球3种重要儿科疾病之一。据统计,在儿童急性下呼吸道感染中,病毒性肺炎所占比例呈上升趋势,而呼吸道合胞病毒作为其中最重要的病原体之一,可以引起婴幼儿毛细支气管炎、支气管肺炎、间质性肺炎等。呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)感染的发病机制尚未完全明确,且目前缺乏安全有效的疫苗和药物进行针对性的预防和治疗。中医药因其辨证论治、作用柔和及副作用少等特点,在治疗儿童呼吸道病毒感染中具有一定的优势。汪教授已研究儿童病毒性肺炎二十余年,根据该病特点和关键病机,研制出金欣口服液,作为临证治疗病毒性肺炎的有效验方,具有宣肺开闭、清热化痰、止咳平喘的功用。前期大量临床和实验研究已表明其可显著抗RSV感染及调节免疫作用。黄芩素是金欣口服液组成药物黄芩的重要有效成分,研究表明具有广谱的抗病毒活性。但是,和许多中医药实验研究一样,上述研究可能存在诸多缺陷,如指标单一、独立、非同步等,难以全面反映药物的作用机制。因此,若深入探讨其治疗作用,应当引入系统化、整体化的研究技术方法以综合分析。代谢组学是系统生物学的重要组成部分,在生物体受到各种外界因素刺激时,能即时、灵敏、真实表现出生物体整体功能的应答与调节。作为一种系统的研究方法,其以机体的整体代谢为研究对象,动态研究生物体受刺激或者扰动之后,其内源性代谢物种类、数量的变化,可以从较为全面的视角发现药物真正的作用机理及其赖以发挥作用的物质基础。因此,本课题组采用代谢组学研究方法,尝试阐明金欣口服液和黄芩素治疗RSV感染的作用,以及其中的作用机制。目的研究RSV肺炎BALB/c小鼠血浆、尿液、肺泡灌洗液、脾脏组织及细胞的代谢特征,进而探讨金欣口服液以及黄芩素对RSV肺炎小鼠的干预作用以及其中可能涉及的代谢调控机制。方法RSV鼻腔吸入法感染BALB/C小鼠之后,分别予以金欣口服液以及黄芩素进行干预,并设正常对照组,分别采集小鼠血浆、尿液、肺泡灌洗液和脾脏组织,行肺部组织病理病理学分析以观察肺部病变情况。培养细胞,予RSV感染1.5-2h后,予黄芩素处理,24h后予以液氮淬灭,以水-甲醇-氯仿提取细胞内代谢物。将上述小鼠样本和细胞样本预处理后,运用气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)分析小鼠的血浆、尿液、脾脏组织和细胞的整体代谢变化,运用超高效液相色谱-离子阱质谱联用(Ultra Performance Liquid Chromatography-LTQ/Orbitrap-Mass Spectrometer,UPLC-LTQ/Orbitrap-MS)研究小鼠肺泡灌洗液中代谢谱变化,利用主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonalpartial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)分析所采集的数据,筛选潜在的血浆、尿液、脾脏、肺泡灌洗液和细胞内的生物标记物,分析相关代谢通路,阐释金欣口服液和黄芩素对RSV肺炎的可能的代谢调控机制。结果1.RSV感染BALB/c小鼠的肺组织病变主要位于肺间质部位,可见肺脏可见间质多灶性炎细胞浸润(++),以单核细胞、淋巴细胞为主;肺泡壁轻度充血(+),肺泡壁明显增厚。分别运用金欣口服液和黄芩素治疗后,肺部充血、水肿、炎性浸润均有不同程度减轻。2.金欣口服液的代谢组学研究(1)血浆:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的血浆的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.934,Q2=0.889,鉴定并筛选了 6个潜在生物标记物,分别为乳酸、尿素、谷氨酰胺、1,5-脱水山梨醇、葡萄糖、花生四烯酸。(2)尿液:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的尿液的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.85,Q2=0.746,鉴定并筛选了 4个潜在生物标记物,分别为乳酸、甘氨酸、硬脂酸、棕榈酸。(3)脾脏组织:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的脾脏样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.959,Q2=0.895,鉴定并筛选了 6个潜在生物标记物,分别为L-脯氨酸、L-谷氨酸、缬氨酸、尿素、次黄嘌呤、葡萄糖,(4)肺泡灌洗液:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的肺泡灌洗液样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.972,Q2=0.924,鉴定并筛选了 6个潜在生物标记物,分别为左旋肉碱、丙酰肉碱、腺苷、二氢神经鞘氨醇、白三烯D5和葡萄糖醛酸雌素酮。3.黄芩素的代谢组学研究(1)细胞:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的肺泡灌洗液样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.974,Q2=0.917,鉴定并筛选了 6个潜在生物标记物,5种差异性代谢物,分别为丝氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸酸、柠檬酸与甘氨酸。(2)血浆:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的血浆样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.912,Q2=0.84,鉴定并筛选了 6个潜在生物标记物,乳酸、尿素、甘氨酸、谷氨酰胺、1,5-脱水山梨醇、D-葡萄糖。(3)尿液:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的尿液样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.917,Q2=0.767,鉴定并筛选了 4个潜在生物标记物,乳酸、苹果酸、棕榈酸、硬脂酸。(4)肺泡灌洗液:正常组、RSV肺炎模型组与金欣口服液治疗组小鼠的尿液样本的OPLS-DA分析显示,三组间能完全分离,无交叉和重叠,模型参数R2Y=0.954,Q2=0.828,鉴定并筛选了5种差异性代谢物,鉴定结果分别为谷氨酸、碳酰肉碱、腺苷、葡萄糖苷酰鞘氨醇、白三烯D5。结论1.运用UPLC/MS和GC-MS分析代谢组学可以从代谢网络的角度阐释金欣口服液和黄芩素治疗RSV感染的作用机制。2.RSV感染BALB/c后,血浆、尿液、肺泡灌洗液及脾脏内的内源性代谢物发生紊乱,主要为氨基酸、有机酸及脂肪酸。3.金欣口服液和黄芩素可以治疗RSV感染,减轻BALB/c小鼠的肺部炎症。4.金欣口服液和黄芩素能够部分调整RSV感染导致的代谢紊乱,其中金欣口服液涉及谷氨酰胺代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢,花生四烯酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,以及丙酮酸代谢;黄芩素发挥治疗作用主要与谷氨酰胺代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关。