研究背景近年来,分子影像对疾病诊疗的关键作用日益彰显,目前已筛选出大量决定疾病发展进程的关键分子靶点,并针对靶点进行定性和定量研究。而作为最早应用于分子影像学的成像技术,核医学成像是为数不多的进入临床应用阶段的分子成像技术。纳米技术不断发展,促进了核医学诊断和治疗的发展,特别是在选择性输送生物活性物质到疾病发生位点方面。由于树状纳米粒PAMAM表面具有大量的活性基团,可以通过双功能螯合剂连接多个放射性核素和靶向分子,因此在低浓度条件下可形成对比度很高的诊断影像。近来,PAMAM在肿瘤诊断和治疗中的应用研究吸引了越来越多的研究者的关注,目前这个方向已经发展成为纳米医药方面研究的一个新选择,是药物运输系统以及制药科学中的一个研究热点[1]。树状纳米分子与特殊肽类的结合能够明显地增加药物与酶传递的靶向效率。RGD作为抗肿瘤药物的靶向载体,目前的相关研究已经相当的成熟,通过与αvβ3整合蛋白的特异性结合,可增加病灶局部的药物浓度,减轻抗肿瘤药物的不良反应。同时,具有双功能团的MAL-PEG-NHS作为纳米载体与靶向多肽的―桥梁‖,能够把PAMAM与RGD连接在一起。在以往的研究中,已有不少研究者利用PEG修饰PAMAM,以改善其生物相容性、并进行药物和基因的传递、释放[2,3,4],以及肿瘤的显像[5]。PEG的加入不仅降低了PAMAM载体的毒性,而且进一步提高了载药系统的亲水性。131I一直是内放射治疗的经典放射性核素,半衰期为8.04天,131I衰变时发射的β射线,能量为0.608MeV,可用于内照射治疗,而同时发射的γ射线可进行体外显像。基于其优良的生化性质,几十年应用不衰,而且不断用于研制新的药物,如标记一些单克隆抗体等[6,7],131I在生物导向治疗中一直发挥着重要作用。131I标记工艺技术至今相当成熟,其中标记化学合成法直接标记法中以Iodogen法和氯胺-T法为主[8,9]。基于131I在临床及基础研究中的成功应用,本实验选择氯胺T直接标记法对纳米载体进行放射性131I的标记,使之成为靶向肿瘤的治疗药物。本研究以树状纳米粒(PAMAM)作为纳米载体,RGD作为肿瘤导向分子修饰药物载体,并用放射性核素131I进行靶向分子标记,合成131I-RGDyC-PEG-PAMAM复合体。与传统的单一树状载体相比,这种新型聚合载体能同时实现治疗、成像和靶向的作用,所取得的研究成果也将具有一定的临床应用价值。本研究主要分为四个部分,第一部分是合成放射性碘标记的前体RGDyC-PEG-PAMAM并检测其质量;第二部分对具有靶向性的纳米载体进行放射性碘标记,并检测其质量;第三部分为纳米探针在生物活性上的研究,包括细胞水平与动物水平的研究。最终探讨将其应用于体内靶向肿瘤显像和诊治药物的可能性。研究目的1、化学合成RGDyC-PEG-PAMAM碘标前体,并对其化学性质、物理性质等进行质量鉴定,评价其是否可用于下一步131I的标记。2、用131I标记RGDyC-PEG-PAMAM纳米复合物,制备131I-RGDyC-PEG-PAMAM放射性纳米探针,并对其标记率、稳定性、脂水分配系数等性质进行鉴定,评价其是否可用于下一步生物学实验。3、初步评估131I-RGDyC-PEG-PAMAM纳米探针在体外细胞水平是否对肿瘤细胞有靶向性,并具有放射抑制的作用,为后续进行荷瘤鼠体内肿瘤显像和抗肿瘤研究奠定基础。4、初步评估131I-RGDyC-PEG-PAMAM纳米探针在动物水平上的药物分布、显像效果。研究方法第一部分放射性标记前体RGDyC-PEG-PAMAM的制备(1)化学合成:在弱酸条件下双功能PEG(NHS-PEG-MAL)上的马来酰亚胺基团先与RGDyC上的巯基基团反应。称取双功能PEG(NHS-PEG-MAL)40mg(17.22μmol),加入到含有环状RGDyC(4mg,6.72μmol)的乙酸钠缓冲液(NaAc-HAc1ml 0.1M pH 6.0)中,在磁力搅拌器的搅拌下反应30s。把上一步反应中混合产物迅速转移至溶解有PAMAM纳米分子(4.2mg,0.15μmol)的硼酸(硼砂-NaOH)缓冲液(1ml 0.05M pH 9.0)中,磁力搅拌下反应12h。12h后把反应混合物的pH值调至7.0,再加入β-巯基乙醇(2μl,28μmol)结合未反应的马来酰亚胺基团,1h后通过超滤(Amicon Ultra-4,MWCO 10000;4500 rpm,15min,9 times)去除游离PEG和RGDyC,把纯化后产物的水溶液冻干得浅黄色固体即为产物RGDyC-PEG-PAMAMA。(2)基本性质检测:称取5mg RGDyC-PEG-PAMAMA溶于0.6ml重水(D2O)中,采用核磁共振波谱仪检测其物质表征。用双蒸水溶解稀释1mg RGDyC-PEG-PAMAMA后,再采用紫外光谱仪表征、用纳米粒度及Zeta电位分析仪检测粒径分布和电位、用透射电镜(TEM)观察其形态大小及分布。第二部分放射性纳米探针131I-RGDyC-PEG-PAMAM的制备(1)化学合成:采用氯胺-T的方法进行放射性核素131I的标记。称取1.5mg RGDyC-PEG-PAMAMA,溶于100μl PBS缓冲液(pH 7.4),再加入Na131I溶液2 mCi(74MBq,200μl),然后加入氯胺-T 300μl(5mg/ml),震荡反应3min后,加入300ul(5mg/ml)偏重亚硫酸钠溶液终止反应,完成标记。(2)基本性质检测:(1)标记率采用快速薄层层析法(ITLC)测定。固定相为:ITLC-SG层析纸,展开剂为甲醇。取2μl反应液点样于ITLC-SG纸(10mm×150mm上),于甲醇中上行展开,空气中自然晾干。在展开体系中,游离131I随溶剂移到层析纸前沿,其Rf为0.9~1.0;而标记物131I-RGDyC-PEG-PAMAMA停留在原点,Rf为0.0~0.1。用Bioscan薄层放射性扫描仪对层析纸条进行扫描,并计算放射性标记率(%)。(2)稳定性检测:取100μl标记后的产物131I-RGDyC-PEG-PAMAMA,分别加入到1ml的新生牛血清和1ml的PBS中。置于37℃水浴箱中孵育2、12、24、72h,分别于不同时间点取少量样品用快速薄层层析法测定其放化纯度,以鉴定其体外稳定性。(3)脂水分配系数测定:在离心管内同时加入500μl正辛醇和480μl PBS,并取20μl131I-RGDyC-PEG-PAMAMA加入该管,用胶封膜密封,充分震荡均匀后,高速离心3min(10000 rpm),至正辛醇与PBS两相平衡。从有机相和水相各取样100μl分别置于两只离心管中,分别测量其放射性计数。重复取样测定三次。按下式计算脂水分配系数,log P=log(cts正辛醇/cts PBS)。第三部分生物活性实验(1)细胞培养:人肺腺癌A549细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养,培养基为含有10%胎牛血清、青霉素(100IU/mL)及链霉素(100IU/m L)的RPMI 1640培养液,每两天更换培养介质。当细胞铺满培养瓶后用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA和0.01mol/L PBS(pH7.4)缓冲液分离用于进一步细胞培养、传代、冻存。(2)细胞摄取及洗脱实验:(1)摄取实验:在24孔板中每孔加入5×104个A549细胞,隔夜培养使其贴壁。隔天取出培养基,细胞分为两组,分别加入10μCi/孔的131I-RGDyC-PEG-PAMAMA和131I-的无血清培养液,在37℃孵育1、2、4、6h。之后再用冰冻PBS缓冲液冲洗3遍,最后用胰蛋白酶消化细胞,收集细胞悬液用γ计数仪测量计数。细胞摄取数据经衰减校正后用百分加入剂量表示作细胞结合率,实验设3个平行样。(2)洗脱实验:在24孔板中每孔加入5×104个A549细胞,隔夜培养使其贴壁。隔天取出培养基,细胞分为两组,分别加入10μCi/孔的131I-RGDyC-PEG-PAMAMA和131I-的无血清培养液,在37℃孵育2h使其充分与细胞结合。然后取出培养液,用冰冻PBS冲洗3遍,再加入无血清培养液再孵育1、2、4、6h。之后再用冰冻PBS缓冲液冲洗3遍,最后用胰蛋白酶消化细胞,收集细胞悬液用γ计数仪测量计数。细胞摄取数据经衰减校正后用百分加入剂量作为细胞滞留率,实验设3个平行样。(3)药物对细胞的抑制作用:等细胞数(1×103)的A549细胞置于96孔板中,分为131I-RGDyC-PEG-PAMAM组、RGDyC-PEG-PAMAM组、131I-组、PBS对照组4个组,每组设9个复孔,一个空白对照孔。用MTT法分别检测A549细胞药物处理24、48、72h后细胞的存活率。(4)细胞凋亡实验:等细胞数(2×105)的A549细胞置于6孔板中,分为131I-RGDyC-PEG-PAMAM组、131I-组、空白对照组3个组,每组设置3个复孔。用流式细胞术(FCM)检测纳米载体作用于细胞所引起的凋亡情况,(5)荷瘤裸鼠动物模型的构建:建立A549细胞荷瘤裸鼠动物模型,采用腋窝皮下细胞悬浮液注射的方法构建移植瘤。(6)131I-RGDyC-PEG-PAMAM在正常鼠体内的不同脏器的放射性分布情况。(1)131I-RGDyC-PEG-PAMAM的荷瘤鼠体内注射:先给予2%KI溶液的饮水使荷瘤鼠模型甲状腺封闭,持续至实验结束,以减少甲状腺组织摄碘。(2)检测注射药物后,不同时刻小鼠不同脏器的放射性药物的分布情况。(7)131I标记的纳米药物载体的荷瘤鼠体内实验:(1)131I-RGDyC-PEG-PAMAM的荷瘤鼠体内注射:先给予2%KI溶液的饮水使荷瘤鼠模型甲状腺封闭,持续至实验结束,以减少甲状腺组织摄碘。(2)不同给药方式注射药物后,各个时间点荷瘤鼠的SPECT显像。研究结果第一部分放射性标记前体RGDyC-PEG-PAMAM的制备合成的放射性标记前体RGDyC-PEG-PAMAM呈淡黄色,经核磁共振氢谱(400MHz,D2O)、紫外吸收光谱确认为目标产物,RGDyC-PEG-PAMAMA的流体动力学的平均粒径为32.67nm。TEM图像显示合成的RGDyC-PEG-PAMAMA为球型纳米复合体,总体直径大小在22nm左右。第二部分放射性纳米探针131I-RGDyC-PEG-PAMAM的制备131I标记RGDyC-PEG-PAMAM的标记率>95%、比活度计算为0.08mCi/mg,72h内不同时间点其稳定性检测,结果显示:至72h时,131I-RGDyC-PEG-PAMAM在不同溶液中(胎牛血清、PBS)均具有良好稳定性。经脂水分配系数实验测定纳米探针的log P=-1.59±0.09,表明此分子探针具有明显亲水性。第三部分生物活性实验(1)细胞摄取及洗脱实验:相对于游离131I-,131I-RGDyC-PEG-PAMAM纳米探针能够与A549细胞特异性结合,而且随着孵育时间延长,其对A549细胞结合率进一步提高。在细胞洗脱实验中,药物131I-RGDyC-PEG-PAMAM组随着时间的延长细胞中的药物出现少量洗脱出来的现象,但变化不太明显,而游离131I-在细胞中的含量从开始一直处于低水平。(2)体外细胞抑制和凋亡实验结果显示:药物131I-RGDyC-PEG-PAMAM对A549细胞产生一定的抑制作用,且与作用时间有一定关系,72h内时间越长对细胞的抑制越明显。在促凋亡方面,相对于游离131I-,131I-RGDyC-PEG-PAMAM的作用较强,且与药物剂量有关,在剂量较高情况下,纳米探针对A549有一定促凋亡和放射杀伤作用。(3)动物学实验(1)体内生物学分布显示:正常小鼠注射131I-RGDyC-PEG-PAMAM后,体内摄取值较高的是肾脏、肝脏,其次是脾脏、小肠及甲状腺,而血液、心脏、肌肉及骨骼等脏器的摄取非常少,说明药物主要通过肝、肾进行代谢排泄。(2)通过不同的给药方式分别将131I-RGDyC-PEG-PAMAM、游离131I-注射入不同的荷瘤鼠体内进行双模态成像,在不同时间SPECT显像分析药物探针131I-RGDyC-PEG-PAMAM在荷A549肿瘤裸鼠体内的药代动力学特征及肿瘤靶向特征。结果显示:肿瘤显影较好,同等条件下与对照组游离131I-组相比,纳米探针在肿瘤局部具有较长的滞留时间,而131I-很快就被排除体外,说明纳米探针与肿瘤的结合具有很好的亲和力,具有特异性结合的作用,特别是瘤内注射方式,其药物在肿瘤中的聚集程度与药物滞留时间均优于尾静脉注射给药。另外,肝肾对药物的摄取较高,肌肉摄取较低,与体内分布实验相似。结论可通过"一锅两步"法及点击化学反应成功制备标记前体RGDyC-PEG-PAMAM,此化学合成方法简便、快捷、高效。合成后的前体通过氯胺T直接标记法成功进行131I标记,合成131I-RGDyC-PEG-PAMAM放射性探针,并获得较高标记率、稳定性和亲水性。随后的体外细胞实验结果显示131I-RGDyC-PEG-PAMAM对A549细胞有一定的抑制生长、促凋亡和放射杀伤的作用。131I-RGDyC-PEG-PAMAM纳米探针体内分布说明药物主要以肝脏与肾代谢排泄为主,其他脏器组织的摄取不高,与SPECT显像的分布情况基本一致。SPECT肿瘤显像结果表明131I-RGDyC-PEG-PAMAM可较好的聚集于荷瘤鼠体内肿瘤部位,具有良好的肿瘤靶向性,为在后续的荷瘤鼠体内抗肿瘤效应研究奠定了很好的基础。总的来说,131I-RGDyC-PEG-PAMAM放射性探针具有作为肿瘤靶向SPECT显像与治疗的潜力。