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研究目的:1.应用高通量测序,筛选甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）中高表达的circRNA;2.验证hsa＿circ＿0076710在PTC细胞中的表达水平与环形结构;3.探索hsa＿circ＿0076710在PTC中的生物学功能及分子机制;4.探讨hsa＿circ＿0076710作为PTC肿瘤标志物的临床价值。研究方法:1.通过高通量测序检测5对PTC癌组织与远癌正常组织样本,构建PTC的circRNA差异表达谱,筛选差异circRNA,确定目标分子。2.利用实时定量PCR（quantitative real time polymerase chain reaction,q RTPCR）在甲状腺癌细胞系中验证circRNA表达量。分别通过以下四种实验方法验证circRNA环形结构:（1）序列验证:设计发散引物,对hsa＿circ＿0076710的PCR产物进行Sanger测序;（2）引物验证:分别设计收敛引物、发散引物,对c DNA和g DNA进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增。（3）RNase R耐受性验证:加入RNase R后,利用q RT-PCR分别扩增hsa＿circ＿0076710及其亲本m RNA。（4）逆转录验证:应用Oligo（d T）和随机六聚体引物分别对hsa＿circ＿0076710及其亲本m RNA进行逆转录。3.敲低hsa＿circ＿0076710后,利用CCK8、平板克隆形成、Ed U实验明确hsa＿circ＿0076710对PTC细胞增殖能力的影响。应用平板划痕、Transwell实验验证hsa＿circ＿0076710对PTC细胞迁移能力的影响。4.建立过表达hsa＿circ＿0076710稳定细胞系,利用CCK8、平板克隆形成、Ed U实验、平板划痕实验、Transwell实验正向验证hsa＿circ＿0076710对PTC细胞增殖和迁移能力的影响。5.通过转录组测序筛选hsa＿circ＿0076710参与的关键信号通路,蛋白免疫印迹（western-blot,WB）进行验证。利用Targetscan、Starbase数据库预测靶基因的海绵mi RNA,应用circBank数据库预测hsa＿circ＿0076710的海绵分子,三者取交集确定候选mi RNA。进一步通过双荧光酶素报告基因进行靶向关系的验证。6.利用CCK8、平板克隆形成、Ed U、细胞划痕、Transwell、WB实验,通过mi R-214-3p inhibitor对敲低hsa＿circ＿0076710进行细胞表型和机制挽救实验（Rescue实验）。7.利用CCK8、平板克隆形成、Ed U、细胞划痕、Transwell、WB实验,通过mi R-214-3p mimics对过表达hsa＿circ＿0076710进行细胞表型和机制Rescue实验。8.纳入203例PTC和20例甲状腺良性病例,通过q RT-PCR分别检测PTC病例中肿瘤组织、远癌正常组织,恶性结节及良性结节穿刺洗脱液、PTC病人及良性病人外周血清中hsa＿circ＿0076710表达情况。利用工作者受试曲线（receiver operator characteristic curve,ROC）,统计曲线下面积（area under the curve,AUC）分析hsa＿circ＿0076710对于PTC诊断和预后的预测价值。进一步应用logistic回归分析hsa＿circ＿0076710表达量与PTC侵袭性病理特征的相关性。研究结果:1.hsa＿circ＿0076710的筛选与结构验证（1）以|差异倍数|＞2且P＜0.05为标准,筛选出差异表达的cicr RNA共85个,其中上调44个,下调41个。在PTC细胞系TPC-1中验证前十个上调表达的分子,验证结果与测序结果一致。体外细胞实验表明,hsa＿circ＿0076710在PTC细胞系TPC-1、K1、BCPAP中高表达（P＜0.01）。（2）Sanger测序证实hsa＿circ＿0076710为反向剪切形成,环化位点正确。（3）c DNA中收敛引物和发散引物均能正确扩增出目标产物,但g DNA只有收敛引物能扩增出目标产物。（4）用RNase R消化后,亲本基因m RNA的丰度明显降低（P＜0.01）,而hsa＿circ＿0076710丰度无明显改变（P＞0.05）。（5）亲本基因m RNA可同时利用Oligo（d T）和随机六聚体引物逆转录,二者产量无统计学差异（P＞0.05）,但hsa＿circ＿0076710以Oligo（d T）为引物时,不能获得有效c DNA,仅能通过随机六聚体引物进行逆转录（P＜0.01）。2.hsa＿circ＿0076710的生物学功能及机制探索（1）敲低hsa＿circ＿0076710后,对TPC-1及K1细胞增殖能力及迁移能力有明显抑制作用（P＜0.01）。过表达hsa＿circ＿0076710后,对TPC-1及K1细胞增殖能力及迁移能力有明显促进作用（P＜0.01）。（2）敲低hsa＿circ＿0076710后,转录组测序结果提示NOTCH通路明显抑制,WB证实相关通路蛋白JAG1、LFNG、NOTCH2、HES1明显下调。（3）双荧光酶素报告基因结果显示mi R-214-3p是hsa＿circ＿0076710和JAG1共同的海绵分子。在PTC细胞系中进行mi R-214-3p inhibitor、mi R-214-3p mimics处理,结果证实前者可促进PTC细胞的增殖和迁移能力,后者抑制了PTC细胞的增殖和迁移能力。（4）共转染si-hsa＿circ＿0076710及mi R-214-3p inhibitor后,mi R-214-3p inhibitor能够恢复si-hsa＿circ＿0076710对细胞增殖及迁移的抑制作用（P＜0.01）。共转染OE-hsa＿circ＿0076710及mi R-214-3p mimics后,发现mi R-214-3p mimics能够恢复OE-hsa＿circ＿0076710对细胞增殖及迁移的促进作用（P＜0.01）。（5）同时敲低hsa＿circ＿0076710及mi R-214-3p后,WB结果显示mi R-214-3p inhibitor能够恢复细胞中JAG1、NOTCH2、HES1的表达量（P＜0.01）。以OE-hsa＿circ＿0076710及mi R-214-3p mimics为组合共转染后,WB结果显示mi R-214-3p mimics能够恢复细胞中JAG1、NOTCH2、HES1的表达量（P＜0.01）。3.hsa＿circ＿0076710的临床价值分析（1）与远癌正常组织相比,PTC组织hsa＿circ＿0076710的表达显著上调,ROC曲线下面积AUC=0.851（95%CI:0.816-0.887）,其灵敏度、特异度分别为88.7%、64.5%。（2）与甲状腺良性结节相比,PTC结节穿刺洗脱液（fine needle aspiration biopsy,FNAB）中hsa＿circ＿0076710的表达显著上调,ROC曲线下面积AUC=0.838（95%CI 0.774-0.902）,其灵敏度、特异度分别为95.1%、58.3%。（3）与良性病人相比,PTC病人血清中hsa＿circ＿0076710的表达显著上调,AUC=0.769（95%CI:0.655-0.883）,其灵敏度、特异度分别为83.7%、65%。（4）hsa＿circ＿0076710表达水平在肿瘤最大径＞1cm、腺外侵犯和淋巴结转移的病人中显著升高。无论男女及年龄,hsa＿circ＿0076710在肿瘤最大径＞1cm、腺外侵犯和淋巴结转移中的表达量明显升高（P＜0.01）,但在不同BMI分组、不同甲状腺功能中表达不一致。研究结论:1.hsa＿circ＿0076710在PTC组织及细胞中均表达上调,且为闭合环状结构。2.体外实验证实,hsa＿circ＿0076710可促进PTC细胞系的增殖、迁移,在甲状腺癌中发挥促癌作用。3.hsa＿circ＿0076710通过竞争性结合mi R-214-3p,调控JAG1/LFNG/NOTCH2/HES1信号通路,促进PTC进展。4.hsa＿circ＿0076710对于PTC的诊断具有重要价值,可能成为新型PTC肿瘤标志物。