大花红景天RcCBF2基因的克隆及抗逆性研究

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低温、干旱和高盐等逆境胁迫,不仅对植物的光合作用和呼吸作用不利,而且对植物的渗透调节等也有影响,严重时导致植物死亡。植物在进化过程中出现了各种应对非生物胁迫的抗性机制,以保护植物自身不受伤害。CBF(C-repeat binding factor)是一类与逆境胁迫应激相关的转录因子,能够识别并结合各种逆境胁迫应激相关基因COR(cold-regulated)启动子区域中的CTR/DRE(C-repeat/dehydration responsive element)顺式作用元件,来激活下游抗逆性基因的表达,从而在转录水平上调控多个抗逆性基因。本研究利用PCR技术,首次从大花红景天(Rhodiola crenulata)中克隆到RcCBF2基因,通过生物信息学分析、植物表达载体的构建、花序浸染法转化拟南芥以及抗逆性的研究,得到的研究结果如下:1.本实验通过PCR方法,从大花红景天中克隆得到RcCBF2基因,经过同源比对发现大花红景天的RcCBF2蛋白与多毛番茄(ACB45088.1)相似性为63%。2.通过对大花红景天RcCBF2蛋白序列的生物信息学分析,结果显示大花红景天RcCBF2蛋白的开放阅读框为693bp,氨基酸残基数为231个,不稳定系数为47.49%,理论等电点为4.93,预测RcCBF2蛋白为酸性,RcCBF2蛋白的亲水性最低得分为-2.844,最高疏水性得分为1.789,预测RcCBF2蛋白具有亲水性。大花红景天RcCBF2蛋白没有信号肽、导肽性,也不存在跨膜结构域。大花红景天RcCBF2蛋白的主要结构为α-螺旋(36.36%)和无规卷曲(46.75%),其次是延伸链(12.55%),最后为β-折叠(4.33%)。大花红景天RcCBF2蛋白含有AP2结构域,并通过同源建模预测了RcCBF2蛋白的三级结构。3.通过双酶切,将目的基因连接在PHB载体上,构建了植物表达载体,转化农杆菌GV3101,并通过花序浸染转化法转化拟南芥,获得转基因拟南芥纯系株系。4.通过记录正常生长条件下野生型和RcCBF2转基因植物根、叶片、花期等特征及测定叶绿体的含量,说明RcCBF2基因过表达可以延缓植物衰老。野生型植物的根长是转基因植物根长的两倍。RcCBF2转基因植物的莲座状丛生叶较野生型的多,花期比野生型的晚,叶绿素含量高于野生型。RcCBF2转基因和野生型植物的衰老过程显示转基因植物可以延缓衰老,RcCBF2转基因植物的叶片出现时间与野生型没有太大差别,但RcCBF2转基因植物的叶片枯萎的较晚。5.通过抗冻性实验发现无论在冷驯化条件下还是非冷驯化条件下,RcCBF2转基因植物的存活率都高于野生型植物。-4℃冷冻胁迫条件下,RcCBF2转基因植物的相对电导率低于野生型植物,说明过表达RcCBF2基因提高了植物的抗冻性。6.通过抗脱水性实验发现经脱水处理后,RcCBF2转基因植物重量为初始重量的27.1±2.2%,高于野生型的16.7±1%,说明RcCBF2基因的过表达增强了植物对脱水的耐受性。7.通过抗盐性处理发现RcCBF2转基因植物的根增长率大于野生型的,RcCBF2转基因植物占初始重量的比值也高于野生型的,说明RcCBF2基因的过表达提高了植物对盐胁迫的抗性。
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