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第一部分FCCP通过线粒体轻微解耦联而减少氧自由基抑制帕金森病神经炎症目的:以小胶质细胞激活为特征的脑内神经炎症是帕金森病(PD)的重要病理学特征。因此,有效调控小胶质细胞的激活或神经炎症的发生对于治疗PD具有重要意义。本研究利用FCCP引起的线粒体轻微解耦联从而改变线粒体相关信号,考察其在PD神经炎症中的功能。方法:使用浓度为10μM的carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone(FCCP)预处理小胶质细胞系BV2并移除,再用脂多糖(LPS)刺激BV2,利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞中促炎症因子i NOS和COX-2的蛋白水平并运用酶联免疫法(ELISA)检测TNFα和IL-6等炎症因子的释放量以评价其炎症激活情况。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time q PCR)检测FCCP对多种炎症相关因子的转录(m RNA)水平的影响,以及运用条件培养基(CM)实验考察经FCCP和LPS处理的BV2培养基对SH-SY5Y细胞系(一种多巴胺能神经元细胞系)存活的影响。运用Western blot检测FCCP预处理对细胞内线粒体数量的影响,同时分别使用TMRM和DCFH-DA检测了线粒体膜电位(ΔΨm)以及细胞内ROS。在此基础上,使用Western blot、细胞免疫荧光以及核质分离实验检测FCCP对NF-κB的影响。最后,我们在小鼠体内运用立体定位注射的方法在中脑黑质(SN)给予FCCP预处理而后用LPS刺激炎症激活,使用免疫组织化学法(IHC)检测了SN中以小胶质细胞增殖活化为代表的炎症激活情况以及多巴胺能(DA)神经元的丢失情况,以此评价FCCP对神经炎症的在体影响。结果:在体外,FCCP预处理所引起的线粒体轻微解耦联能够显著抑制BV2在LPS刺激条件下i NOS、COX-2、TNFα和IL-6等炎症相关因子蛋白水平以及转录水平的升高而抑制小胶质细胞激活。条件培养基实验进一步证明FCCP的预处理可以明显减少由于小胶质细胞激活导致的SH-SY5Y神经元的死亡。我们发现FCCP预处理并未影响线粒体的数量,但是可以通过轻微的线粒体解耦联导致线粒体膜电位降低而减少LPS刺激条件下ROS的产生。而进一步发现FCCP通过抑制NF-κB的磷酸化和核转位从而抑制小胶质细胞的激活。最后,我们在小鼠体内也验证了FCCP的抑制神经炎症的效应,以及对SN中DA神经元的保护作用。结论:FCCP通过其轻微的线粒体解耦联作用抑制ROS的产生以及NF-κB的活化从而抑制小胶质细胞的激活并保护神经元,并且其在小鼠体内也表现出良好的抑制神经炎症及保护神经元的效应。第二部分mTOR抑制剂Rapamycin通过自噬非依赖方式抑制帕金森病神经炎症目的:mTOR(Mammalian Target of Rapamycin)作为老年相关疾病的关键调节因子,其在神经退行性疾病以及炎症反应当中的作用备受关注,我们在帕金森病(PD)神经炎症模型中考察mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)对神经炎症的作用及其机制。方法:使用低浓度的两个经典的mTOR抑制剂Rapamycin(10 n M)和Torin1(1n M)分别预处理体外培养的小胶质细胞系BV2,再加以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激,运用Western Blot检测促炎症因子诱导型一氧化氮合酶(i NOS)和环氧合酶-2(COX-2)的蛋白表达水平,运用试剂盒检测细胞培养基中的一氧化氮(NO)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和前列腺素2(PGE2)释放量,运用实时定量PCR(q PCR)检测促炎症介质i NOS、COX-2、IL-6和TNFα的m RNA水平,以此评价mTOR抑制剂对小胶质细胞激活的抑制作用。使用小干扰RNA si-mTOR特异敲低mTOR并考察小胶质细胞的激活情况,以证实以上mTOR抑制剂的效应的确是依赖于其对mTOR的抑制作用。使用小干扰RNA si-Atg-5特异敲低Atg-5并检测Rapamycin和Torin1对小胶质细胞激活的影响,以证明低浓度mTOR抑制剂在不依赖于自噬诱导的情况下对小胶质细胞发挥的效应。分别构建NF-κB和AP-1荧光素酶报告基因细胞系,考察mTOR抑制剂对这两个最主要的炎症相关转录因子的影响。在体外使用条件培养基实验检测mTOR抑制剂Rapamycin对LPS诱导的小胶质细胞的激活所造成的原代神经元损伤的影响。在小鼠体内利用脑立体定位注射技术以及后续的q PCR、免疫组织化学染色(IHC)进一步明确mTOR抑制剂Rapamycin对PD神经炎症的影响。结果:低浓度的mTOR抑制剂Rapamycin和Torin1处理细胞未见明显的自噬诱导作用,但可以从转录以及蛋白水平抑制LPS诱导的小胶质细胞中包括i NOS、NO、COX-2、PGE2、IL-6和TNFα在内的促炎症因子的高表达,并且此效应与mTOR敲减时一致。此外,Rapamycin和Torin1在Atg-5敲减的小胶质细胞中也仍然可以抑制小胶质细胞的激活。进一步提示低剂量mTOR抑制剂Rapamycin和Torin1可以通过自噬非依赖的方式抑制炎症。荧光素酶报告基因实验显示Rapamycin是通过明显抑制AP-1而非NF-κB的转录活性而抑制小胶质细胞的激活。在体外条件培养基实验中,Rapamycin通过抑制LPS诱导的小胶质细胞激活而保护原代神经元免于小胶质细胞炎症激活造成的损伤或死亡。小鼠在体的脑立体定位注射实验以及后续的q PCR和IHC实验均证实Rapamycin可以抑制LPS诱导的以小胶质细胞和星形胶质细胞大量激活为标志的神经炎症,从而保护中脑黑质(SN)多巴胺能(DA)神经元免于神经炎症导致的死亡。结论:低剂量mTOR抑制剂Rapamycin可以通过非自噬依赖的方式抑制重要的炎症相关的转录因子AP-1的转录活性从而抑制小胶质细胞的激活。并且其在体外和体内帕金森病神经炎症模型当中均能通过抑制炎症而保护神经元。