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牛病毒性腹泻/黏膜（Bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD）作为一种接触性传染病,感染家畜及野生动物后,引起高热、腹泻、黏膜充血、以及母畜产奶量下降和流产死胎等一系列临床症状。Occludin（OCLN）是紧密连接相关蛋白（Tight junction,TJ）中负责维持细胞渗透压的屏障调节功能和帮助细胞极性形成的栅栏功能的蛋白质。大量研究报道,OCLN能够在丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）进入细胞时起到连接靶细胞受体的作用,从而启动病毒在胞内的复制。BVDV与HCV同属黄病毒科,而OCLN与BVDV之间的作用机制未见相关报道,作为同科属病毒,OCLN是否在BVDV感染过程中也起到关键性作用?前期本课题组已通过CRISPR/Cas9基因敲除和RNAi敲低等技术,敲除/低OCLN在BVDV靶细胞MDBK中的表达,发现OCLN敲除/低都将严重影响BVDV在宿主细胞中复制。本研究通过慢病毒介导OCLN在BALB/c小鼠体内过表达,以BVDV感染小鼠的方式,研究OCLN是否对BVDV体内复制产生影响探明OCLN与BVDV之间的作用关系,为防控BVD/MD和抗BVDV提供理论基础。具体内容如下所示:目的:为研究紧密连接蛋白（Occludin,OCLN）是否影响牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus,BVDV）在BALB/c小鼠体内的复制。方法:构建慢病毒表达载体,将OCLN-GFP载体连同辅助质粒（p SPAX2和p MD2.G）共同转染至HEK-293T细胞中（选取GFP质粒转染组为对照组）,在48 h通过荧光显微镜观察转染的细胞中是否有大量绿色荧光,待绿色荧光蛋白大量表达后,收集OCLN-GFP慢病毒悬液并测定其滴度;将1月龄BALB/c小鼠随机分为A（0 d）、B（4 d）、C（8 d）、D（10 d）、E（15d）五组,每组分别注射滴度为5×10~7 IU的OCLN-GFP（实验组）和GFP（对照组）慢病毒悬液,连续注射两次,中间间隔48 h。在第二次注射后的96 h,尾静脉注射BVDV,滴度为1.68×10~5 TCID50每只,分别于BVDV攻毒后的0、4、8、10、15 d,解剖小鼠并采集不同器官的组织,提取总RNA及总蛋白,并测定浓度,使用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR）技术检测不同组织中OCLN m RNA表达量和不同组织中不同天数的BVDV病毒载量;使用Western blot技术检测不同组织中OCLN蛋白表达量;并将剩余各组织制作不同天数的组织切片,观察其病变情况。结果:荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白大量表达并测定慢病毒滴度符合注射动物病毒标准,证明成功包装OCLN-GFP和GFP慢病毒;慢病毒感染BALB/c小鼠96 h后,OCLN-GFP较GFP组,实时荧光定量检测OCLN m RNA含量和Western blot检测各组织蛋白表达水平均呈现显著增加;与GFP相比,OCLN-GFP组q RT-PCR检测各组织病毒载量从攻毒4 d后出现显著性增加;病理切片结果表明,BVDV攻毒4 d后,小鼠肺脏及肝脏器官最早出现明显病变,其他器官病变不明显,攻毒8 d后,肝脏、肺脏病变程度加重,其他器官出现明显病变且有加重现象;OCLN-GFP较GFP组在BVDV感染小鼠8d后,组织病变更加严重。本研究结果表明慢病毒介导的OCLN过表达能显著性增加BVDV在BALB/c小鼠体内的复制,与GFP组相比,BVDV感染的OCLN-GFP组造成的肝脏、脾脏、肺脏等器官病变更严重,为阐明OCLN介导BVDV复制的机制提供重要理论依据。