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目的:研究脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)应激的IEC-6细胞来源外泌体介导其差异miR-218a-5p对IEC-6细胞的增殖、迁移影响,并初步探讨其促进IEC-6细胞迁移在肠粘膜损伤修复的可能作用机制,阐明甘草酸对此途径的影响。方法:1.通过试剂盒结合超速离心法分离IEC-6细胞来源外泌体,利用透射电镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)和Western blot鉴定外泌体。2.通过高通量测序来分析LPS诱导的IEC-6细胞来源外泌体中miRNAs的表达谱差异,并对样品中差异表达的miRNAs进行GO和KEGG富集分析,预测其可能的信号通路。3.采用Exo-Green荧光标记IEC-6来源外泌体,分析同是大鼠种属的六种不同组织细胞对IEC-6细胞来源外泌体的亲和力;通过EdU实验、MTT实验、Ibidi细胞划痕实验评价LPS应激外泌体及其差异miR-218a-5p对IEC-6细胞增殖和迁移能力的影响;采用Exo-FectTM外泌体转染试剂盒转染入miR-218a-5p,转染好的外泌体与IEC-6细胞共孵育,通过Ibidi细胞划痕实验检测LPS应激外泌体是否介导miR-218a-5p促进IEC-6细胞迁移。4.利用生物信息学软件预测和分析rno-miR-218a-5p的潜在靶基因,并通过RT-qPCR 和 Western blot 检测 miR-218a-5p 对 FERMT3 在 mRNA 和蛋白水平的表达影响,初步观察miR-218a-5p对FERMT3的可能靶向作用,并检测miR-218a-5p对整合素蛋白Integrin α 4表达的影响;同时检测miR-218a-5p对CaMK Ⅱ γ在mRNA和蛋白水平的表达影响;通过转染siRNA沉默CaMKⅡγ,初步分析miR-218a-5p是否通过沉默CaMKⅡγ蛋白促进IEC-6细胞迁移。5.通过EdU实验、Ibidi细胞划痕实验分析甘草酸作用的外泌体对IEC-6细胞增殖和迁移能力的影响;采用All-in-OneTM miRNA qRT-PCR定量检测甘草酸作用的外泌体对rno-mi R-218a-5p的表达的影响。结果:1.TEM观察到大小较均一的圆形或类圆形双层脂质膜性结构,呈茶托样的微囊泡,直径约40～120 nm的外泌体;NTA粒径检测显示外泌体粒径主峰峰值位于155 nm处,整体浓度为2.82 × 109 particles/mL;Western blot结果显示试剂盒结合超速离心分离的外泌体样品中表面标志蛋白CD63表达阳性。结果提示采用试剂盒结合超速离心分离外泌体的方法可靠,其分离的外泌体可用于进行后续的实验。2.高通量测序分析结果显示,两样本外泌体中共检测出198个差异表达的miRNA(|log2(Fold Change)|>1),与 Control-exosome 对照组比较,LPS-exosome组 19个miRNA表达上调,179个miRNA表达下调。而差异倍数(|log2(Fold Change)|>1)且差异具有统计学意义(P<0.05)的前21个miRNA中9个miRNA表达上调,12个miRNA表达下调。其中,与 Control-exosome 组比较,LPS-exosome 组 rno-miR-218a-5p 在所有差异miRNA中表达量最高,为Control-exosome对照组的2.5倍且表达明显上调,差异显著(P<0.01);GO和KEGG富集分析预测到的信号通路主要有Wnt信号、轴突导向、神经营养因子的信号转导、焦点粘附、白细胞穿膜迁移、趋化因子和血管内皮生长因子等,提示LPS诱导的IEC-6细胞来源外泌体差异miRNAs预测的大多数信号通路涉及细胞迁移。3.流式细胞仪检测IEC-6细胞对荧光标记外泌体的摄入率高达99.1%,表明IEC-6细胞来源的外泌体对其来源细胞的亲和力最强,故选用IEC-6细胞作为后续实验的靶细胞;细胞增殖实验结果显示:分别处理EC-6细胞24 h、48 h后,与Control-exosome对照组比较,EdU检测LPS-exosome组IEC-6细胞的增殖能力均未发生变化;转染miR-218a-5p 24 h、48 h后进行MTT和EdU检测,发现miR-218a-5p模拟物组、抑制物组与各自的对照组比较,IEC-6细胞的增殖能力也未发生变化,这表明差异miR-218a-5p对IEC-6细胞的增殖影响也不大;Ibidi细胞划痕实验结果表明:与Control-exosome对照组比较,LPS应激外泌体能促进IEC-6细胞迁移,差异明显(P<0.05);与NC模拟物阴性对照组比较,miR-218a-5p模拟物增强IEC-6细胞伤口愈合能力,促进细胞迁移(P<0.05),但与inhibitor NC抑制物阴性组比较,miR-218a-5p抑制物在细胞迁移方面并未发生明显变化;外泌体转染后细胞划痕实验结果表明:与各自对照组比较,Control-exosome转染入miR-218a-5p模拟物能促进IEC-6细胞迁移(P<0.05),同时LPS-exosome转染入miR-218a-5p抑制物后能拮抗LPS-exosome对IEC-6细胞的促迁移作用(P<0.05),即抑制miR-218a-5p能逆转LPS应激外泌体对IEC-6细胞的促迁移作用,提示LPS应激外泌体可能通过介导miR-218a-5p促进IEC-6细胞迁移。4.生物信息软件预测结果显示:FERMT3可能为miR-218a-5p的一个潜在靶基因,并与细胞迁移有关;Western blot和RT-qPCR实验结果表明:与转染阴性对照NC组比较,转染miR-218a-5p mimic组IEC-6细胞FERMT3 mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05),Integrin α 4蛋白表达明显下调(P<0.05,CaMKⅡγ mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01);Ibidi细胞划痕实验表明,与转染阴性对照siR-NC 比较,沉默CaMKⅡγ蛋白表达能够促进IEC-6细胞迁移(P<0.05),提示mi R-218a-5p可能通过沉默CaMKⅡ γ蛋白可以促进IEC-6细胞迁移。5.EdU实验结果表明,与对照Control-exosome组比较,甘草酸作用的外泌体组细胞增殖率均未发生明显变化,表明甘草酸作用的外泌体对IEC-6细胞的增殖能力影响不大;Ibidi细胞划痕实验显示:与Control-exosome对照组比较,甘草酸作用的外泌体能促进IEC-6细胞迁移(P<0.05);miRNA qRT-PCR实验表明,与Control-exosome对照组比较,甘草酸作用的外泌体能上调rno-miR-218a-5p的表达(P<0.05)。结论:1.采用试剂盒结合超速离心法,成功分离纯度较好的IEC-6细胞源性外泌体。2.高通量测序和GO和KEGG分析,LPS诱导的IEC-6细胞来源外泌体中rno-miR-218a-5p表达量高且显著上调,并可能参与细胞迁移,对肠粘膜损伤修复存在潜在的调控作用。3.LPS应激外泌体及其差异miR-218a-5p均能促进IEC-6细胞迁移,LPS应激外泌体通过介导mi R-218a-5p促进IEC-6细胞迁移的机制。4.miR-218a-5p 可能通过下调 FERMT3,Integrin α 4 和 CaMKⅡ γ 表达促进IEC-6细胞迁移。5.甘草酸作用的外泌体能促进IEC-6细胞迁移,这可能与其上调miR-218a-5p相关。