拟南芥茎端分生组织突变体sam9-6的分离与目标基因的定位

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在从拟南芥MYB家族46个T-DNA插入家系中筛选突变体的过程中,发现第9个家系中的一株编号为9-6的植株表现出明显的异常表型:发育迟缓,抽苔开花较野生型晚;各器官体积减小,叶片、叶柄短小,成熟荚果粗短,成株矮小;茎端分生组织和侧生分生组织提前终结;花序由无限花序变为有限花序;叶片颜色加深;叶片簇生。经过遗传分析,确定该单株是单基因隐性突变体。由于该突变体表现为茎端分生组织功能缺陷,因此本研究将其命名为sam9-6。对sam9-6进行进一步的研究,包括卡那抗性检测、突变性状与T-DNA插入共分离分析等,证实sam9-6与T-DNA插入无关。已知突变体tfl的表型与sam9-6的表型极为相似,但是经过特异引物TFL1-F/TFL1-R的PCR扩增以及序列分析,发现sam9-6的TFL基因没有突变,排除了目标基因是TFL的可能性。首先构建了一个由200个F2代单株组成的小群体用于初步定位,根据表型筛选到50株纯合突变植株并提取叶片基因组DNA,利用分布于拟南芥5条染色体上的平均间距为20cM的22对SSLP标记进行扩增分析,发现目标基因与拟南芥第4条染色体上两个标记CIW6和CIW7连锁,其它20个标记都没有与目标基因表现出明显的连锁,说明目标基因位于拟南芥第4条染色体上。这一初步定位进一步说明了sam9-6与T-DNA插入无关(插入位点AT1G18960在第1条染色体上)以及目标基因与TFL(在第5条染色体上)不是同一基因。扩大定位群体进行精细定位,构建大约由1000株F2代单株组成的大群体,从中筛选到200株纯合突变F2代单株。在CIW5和CIW6之间距离CIW6 5.8cM的位置及CIW6和nga1107之间距离CIW6 0.7cM的位置分别增加标记F24G24和FCA5,目标基因被进一步锁定在标记F24G24和CIW6之间的1470Kb的距离之内。继续在F24G24和CIW6之间增加三对标记F7L13、F25I24-18和T26M18,最终将目标基因锁定在标记F7L13和T26M18之间的650K左右的距离内。
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