研究背景心血管病变是糖尿病患者的主要死亡原因,其大血管病变(主要是动脉粥样硬化)和微血管病变是糖尿病病人致病率和死亡率最主要的原因之一。糖尿病导致心血管病的机制是复杂的、多方面的,其中血管内皮功能异常是糖尿病血管并发症发生的重要因素。高血糖可通过糖基化终末产物(AGEs)途径、多元醇途径、蛋白激酶C激活途径、己糖胺途径和氧化应激等多种机制导致血管内皮细胞功能不全,其损伤的机理并不十分清楚,其中高糖诱导内皮细胞凋亡是研究重点和热点之一。细胞凋亡(apoptosis),亦称为程序化的细胞死亡(Programmed cell death,PCD),是一种不同于细胞坏死的生理性或者病理性的死亡过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等多个方面。目前认为,细胞凋亡在器官发育、伤口愈合、免疫反应等过程中调控细胞增殖与更新间的平衡,维持组织器官正常生理功能及细胞数量的相对稳定。高胰岛素血症、AGEs、血管紧张-Ⅱ、氧化的LDL、活性氧(reactive oxygen species,ROS)以及炎性细胞因子等多种因素均可诱导血管内皮细胞发生凋亡。研究证实,高糖诱导活性氧的产生,而活性氧进一步能引起细胞功能失调,甚至细胞死亡。细胞凋亡在高糖对内皮细胞损伤过程中扮演重要的角色。因此,防治高糖诱导的内皮细胞的凋亡在预防糖尿病血管并发症方面具有重要的作用。研究证明,Akt的激活能促进内皮细胞的存活。Akt,又称PKB,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,主要通过PI-3K激活。Akt的Ser-473和Thr-308位点被磷酸化后,产生一系列生物学效应。PI-3K在多种死亡信号诱导的细胞死亡过程中起着重要的预防作用。Akt能引起抗凋亡基因家族bcl-2的表达,激活内皮源性的一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),从而产生NO防止超氧阴离子产生歧化产物。因此,PI-3K/Akt/NO信号通路在防止ROS诱导的内皮细胞凋亡方面发挥着重要的作用。因此,该信号通路是本研究的焦点之一。NF-κB是多种信号通路的交汇点,NF-κB的激活能控制炎症反应、细胞生长、存活和凋亡过程中的多个基因的转录。最近的研究证明,NF-κB的激活能下调促凋亡的JNK信号途径,进而预防多种细胞类型的凋亡。但是,对于内皮细胞而言,NF-κB的激活能促进凋亡,ROS依赖的NF-κB的激活在高糖诱导的内皮细胞凋亡过程中具有重要作用。因此,NF-κB途径也是研究的重点之一。西红花酸是西红花(Crocus sativus L.)提取物的有效成分之一(近年从栀子中也成功提取出相同的有效结构),有多不饱和共轭烯酸结构,属于类胡萝卜素类。研究表明西红花酸具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、降血脂、心肌保护、肝脏保护以及精神神经疾病的保护治疗作用。西红花酸对糖尿病亦具有有益的保护作用。但是,西红花酸是否能抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡,国内外未见报道。因此,本文通过内皮细胞的体外培养,建立高糖诱导内皮细胞凋亡模型,从生化指标、形态学、蛋白表达等多方面比较系统地观察了西红花酸对高糖诱导内皮细胞凋亡的抑制作用并探讨其可能的机制,为西红花酸在临床用于防治糖尿病及其血管并发症提供理论依据。第一部分高糖体外诱导内皮细胞凋亡及西红花酸对其抑制作用的观察目的观察高糖对人脐静脉内皮细胞的促凋亡作用及西红花酸对其抑制作用。方法取健康、足月新生儿产后的新鲜脐带,原代培养、传代脐静脉内皮细胞并根据细胞的形态、生长习性以及Ⅷ因子抗原等鉴定。选生长良好的HUVECs第3-5代用于试验。试验分为:①对照组(NG):含有终浓度5.5mM的葡萄糖,与内皮细胞共同培养24,36,48h。②高糖15组(HG15):含有10%胎牛血清的RPMI1640培养液和含终浓度为15mmol/L的葡萄糖,与内皮细胞共同培养24,36,48h。②高糖组33(HG33):含有终浓度为33mM的葡萄糖,与内皮细胞共同培养24,36,48h。③高糖组+西红花酸组:不同终浓度的西红花酸(0.01,0.1,1.0μM;分别为HG+C1,HG+C2,HG+C3组):与内皮细胞预先培养18h,然后加入终浓度为33mM的葡萄糖刺激,继续共同培养24,36,48h。在不同的时间点收集细胞,观察西红花酸对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响,分别采用相差显微镜和荧光显微镜结合Hoechst 33258细胞DNA染色,观察细胞凋亡形态改变;双抗体夹心酶免疫法特异性检测细胞溶解物中的核小体片段;应用ELISA法检测凋亡效应子caspase-3的活性。脐静脉内皮细胞的鉴定及细胞凋亡的形态学鉴定方法:在倒置相差显微镜下观察显示,人脐静脉内皮细胞原代培养时,呈单层铺路石样。通过Ⅷ因子抗体免疫细胞化学检测,原代和传代培养的内皮细胞胞浆内见阳性的棕色颗粒。凋亡的内皮细胞Hoechst染色后,细胞核呈明显形态变化,可见染色质浓染,或呈碎块状致密浓染等特征性变化;在荧光显微镜下,凋亡的内皮细胞中染色质浓缩,核染色较明亮,成新月形或分叶状的蓝色核,细胞核可裂解为大小不一的碎片,可见凋亡小体。而正常细胞的胞核形态大小较为一致,正常细胞核发出均匀蓝色荧光,染色较弱。结果成功培养原代内皮细胞并传代,按照上述分组给予干预。结果显示,在高糖条件下,培养24h内,凋亡并不明显。36h后凋亡的内皮细胞数目明显增多。细胞凋亡试剂盒的检测结果发现,高糖诱导的内皮细胞凋亡在36h和48h显著增加(与0h和24h相比,p＜0.01)。而且,在孵育48h的凋亡比36h时明显增加(p＜0.01)。caspase-3的检测显示,高糖作用于HUVEC_s36和48h后,caspase-3活性明显增加(与0h和24h相比,p＜0.01),而且,48h时的活性显著高于36h(p＜0.01),同时,凋亡随着高糖浓度的增加而增加。西红花酸对高糖诱导的内皮细胞凋亡的影响:相差显微镜和荧光显微镜都发现,HUVEC_s与西红花酸预先孵育18h,再与高糖共同培养,内皮细胞的凋亡数目明显减少。细胞凋亡试剂盒ELISA分析表明,高糖时间依赖性地诱导内皮细胞凋亡,而预先与西红花酸孵(0.1,1.0μM)育后内皮细胞的凋亡明显减轻。高糖诱导的内皮细胞Caspase-3的活性增加办可被西红花酸(0.1,1.0μM)所显著抑制。但是在西红花酸的低浓度(0.01μM)抑制作用不明显。结论1.高糖在与内皮细胞共同孵育36h后能诱导脐静脉内皮细胞的凋亡,而且,凋亡随着高糖浓度的增加而增加。2.西红花酸剂量依赖性的抑制高糖诱导的内皮细胞的凋亡。第二部分西红花酸抑制高糖诱导的内皮细胞凋亡的机制研究目的本研究旨在探讨红花酸抑制高糖诱导的脐静脉内皮细胞凋亡的机制。方法以西红花酸(1.0μM)与HUVEC_s预先孵育18h,然后以高糖(33mM)诱导内皮细胞凋亡48h,以终浓度为5.5mM的葡萄糖为正常对照。分别检测培养上清液中MDA、SOD的活性并以DCFH-DA为探针检测细胞的ROS,以观察西红花酸的抗氧化作用;应用PI-3K抑制剂LY294002(10μM)、NOS抑制剂L-NAME(100μM)或NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC,10μM)与内皮细胞预先孵育,然后收集细胞,以分别研究西红花酸对PI-3K/Akt/eNOS和NF-κB/JNK/Caspase-3途径的影响。以Western blot方法检测p-Akt、Akt、p-eNOS、以及IκB、p-JNK蛋白含量变化,以EMSA法测定NF-κB的活性,观察西红花酸和高糖对PI-3K/Akt/eNOS通路、NF-κB途径的影响,而且观察外源性NO(sodium nitroprusside,SNP,10μM)和内源性NO对NF-κB的活性,探讨西红花酸拮抗高糖诱发内皮细胞凋亡的可能机制。结果本研究发现西红花酸能抑制高糖诱导HUVEC_s的凋亡,该作用可被PI-3K抑制剂LY294002、NOS抑制剂L-NAME(NG-nitro-arginine methyl ester)所减弱。西红花酸能增加Akt和eNOS的磷酸化,增加NO产量:NF-κB的抑制剂PDTC能明显抑制p-JNK的蛋白表达和Caspase-3的活性,而西红花酸能增加IκB的蛋白表达,抑制高糖诱导的NF-κB活性的升高,以及降低p-JNK的表达,抑制Caspase-3的活性;外源性和内源性NO均可抑制NF-κB的活性。结论1.高糖能通过对NF-κB/JNK/Caspase-3途径的活化和对Akt/e-NOS/NO的抑制诱导内皮细胞凋亡。2.西红花酸具有很强的抗氧化活性。3.西红花酸一方面通过抑制高糖激活的NF-κB/JNK/Gaspase-3途径,另一方面,增加Akt和eNOS的磷酸化,通过Akt/eNOS/NO途径,抑制高糖诱导的内皮细胞的凋亡。而且,西红花酸通过PI-3K/Akt/eNOS途径对NF-kB的活性有反馈抑制。4.西红花酸有助于防治糖尿病血管并发症的发生,这为西红花酸在临床中的应用提供了重要的理论根据。