研究背景和目的间质性肺疾病(interstitial lung disease, ILD)是可累及肺间质、腺泡以及气道的一组疾病,在终末细支气管末端有各种细胞浸润和胞外基质的沉积,表现为肺泡-毛细血管功能单位的逐步丧失,最后进展为弥漫的肺纤维化和蜂窝肺。间质性肺疾病分为五大类,其中关于特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)的病理生理过程的研究是目前研究的热点,其确切的发病机制尚未完全阐明,现在仍缺乏特异有效的阻止或逆转特发性肺纤维化的治疗手段。目前的研究中,公认IPF发病机制为肺泡上皮细胞的损伤。上皮-间质转分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)是肺纤维化重要的特征,上皮细胞损伤后的修复失调是其关键的病理生理改变。气道上皮细胞在纤维化的始动因素作用下向间充质细胞(包括肌纤维母细胞、成纤维细胞等)转分化,上皮细胞极性与细胞间连接、粘附结构消失,细胞骨架重组,细胞器重新分布等间质细胞样改变,同时Ⅰ型胶原和纤维结合素合成增多,出现肌纤维母细胞的生物学行为成为肺间质纤维化的细胞学变化基础。目前对肺纤维化EMT的机制尚未完全了解,但最新的研究证实与EGFR/Akt、TGF-β/Smad等信号通路有关。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)为170kDa的跨膜糖蛋白,是原癌基因产物,广泛存在于大多数上皮细胞和神经外胚层来源的细胞膜上,提供细胞生长、分化的信号,由其特定的配体表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和转化生长因子α (transforming growth factor α, TGF-α)活化。EGFR依赖于胞内酪氨酸激酶的活化,刺激其下游的MAPK、Akt、JNK等信号通路,从而促进DNA的合成及细胞的迁移、聚集和增殖。致炎、氧化损伤等因素的持续存在使EGFR过度活化是纤维化的一个重要因素,多个研究表明EGFR参与了纤维化EMT的过程。EGFR信号不仅促进上皮细胞向间充质细胞的转分化,而且能够延长已转分化间质细胞的寿命,最终加重纤维化程度。表皮生长因子家族及其受体在间质性肺疾病发生、发展中起关键作用,是参与上皮-间质转分化的重要因素。转化生长因子-β (transforming growth factor, TGF-β)是调控增殖、细胞分化和其他细胞功能重要因子,同时也是与上皮细胞间质转分化密切相关的一个重要信号系统,在组织器官纤维化中TGF-β主要是以依赖Smad的方式诱导EMT。有研究证实EGF能够通过促进增殖及E-钙粘蛋白(E-cadherin, E-cad)的丢失,以抑制细胞凋亡并促进TGF-β诱导的EMT。另有研究表明,虽然TGF-β1不是EGFR配体,但仍可间接的激活EGFR并且使其磷酸化,使下游与EMT胶原蛋白合成的相关基因活化,促进了成纤维细胞合成、分泌胶原蛋白与EMT。在肺纤维化过程中,是否存在着EGFR与TGF-β的相互作用,它们间是如何相互调控的?本课题组的前期研究结果显示,博来霉素(bleomycin, BLM)致肺纤维化小鼠模型肺组织中EGFR表达升高,小鼠肺组织病理损伤加重、纤维化评分数值增高,同时伴有EGFR/Akt通路活化增加,TGF-β1的活化增加、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达增多、羟脯氨酸含量明显增加；用EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)中和EGFR后,肺组织中EGFR浓度下降,小鼠肺组织病理损伤减轻、纤维化评分数值降低,EGFR/Akt通路活化降低,TGF-β1的活化降低,α-SMA表达减少、羟脯氨酸含量明显降低。为此,我们将继续深入探讨EGFR与TGF-β在纤维化进程中的相互作用,阐明吉非替尼抑制博来霉素致肺纤维化进程中上皮-基质转分化的机制,有助于发现肺纤维化的治疗靶点,而针对EGFR的调控有望成为缓解肺纤维化的一个新的治疗策略。为明确EGFR与TGF-β二者在肺纤维化EMT进程中的相互关系,揭示肺纤维化过程中EMT的调节机制。本课题采用博来霉素诱导小鼠肺纤维化模型,检测上皮细胞间质转分化相关指标变化；运用EGFR-TKI及TGF-β受体I抑制剂(transforming growth factor receptor I inhibitor, TGF-β RI inhibitor),探讨抑制EGFR/Akt通路后博来霉素小鼠TGF-β/Smad通路活性的变化,抑制TGF-β/Smad后博来霉素小鼠EGFR/Akt通路活性的变化,阐明肺纤维化EMT中EGFR-TGFβ存在正反馈环路共同对EMT进行调控。本研究阐明肺纤维化EMT的可能调控机制,将为寻找肺纤维化的关键靶点、制定治疗策略奠定良好基础。研究方法1吉非替尼下调博来霉素致肺纤维化小鼠的上皮-间质转分化小鼠随机分为对照组(Control)、博来霉素组(BLM)、吉非替尼处理组(BLM+Ge)。BLM组气道内雾化BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组雾化等体积生理盐水；BLM+Ge组小鼠雾化BLM后每天给予吉非替尼(20mg/kg,100μL)灌胃,对照组与BLM组予相同体积生理盐水灌胃。第14天收集标本。小鼠开胸取肺,将肺组织置于10%中性甲醛固定48小时后,石蜡包埋、切片行HE和Masson染色,参照Mikawar和Ashcroft法对肺病理损伤和纤维化程度进行评分。肺组织匀浆后抽提总蛋白,Western blotting检测α-SMA、 E-cadheru、Fibronectin蛋白表达水平。2吉非替尼下调博来霉素致肺纤维化小鼠TGF-β通路活化气管内雾化BLM溶液复制小鼠肺纤维化模型,小鼠分为对照组、BLM组、BLM+Ge组。BLM组与BLM+Ge组小鼠气道内雾化BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组雾化与BLM溶液等体积的生理盐水。BLM+Ge组在BLM处理后予吉非替尼(20mg/kg/d,200μL)灌胃。14天后取样,ELISA检测血清TGF-p1水平,Western boltting检测肺组织EGFR、Erk、Smad2/3蛋白表达及磷酸化水平。3TGF-βRI抑制剂下调博来霉素致肺纤维化小鼠EGFR通路活化气管内雾化BLM溶液复制小鼠肺纤维化模型,小鼠分为对照组、BLM组及TGF-βRI抑制剂处理组(BLM+Ly)。BLM组与BLM+Ly组小鼠气道内雾化BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组雾化与BLM溶液等体积的生理盐水。BLM+Ly组在BLM处理后予TGF-βRI抑制剂(10mg/kg/d,200μL)灌胃。第14天收集标本。小鼠开胸取肺,将肺组织置于10%中性甲醛固定48小时后,石蜡包埋、切片行HE和Masson染色,参照Mikawar5]和Ashcroft[16]法对肺病理损伤和纤维化程度进行评分。ELISA检测血清TGF-p1水平,Western Boltting检测肺组织Smad2/3、c-Src、EGFR蛋白及磷酸化水平。4统计学处理应用SPSS13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(X±S)表示。所有数据均进行方差齐性检验,组间均数比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。方差齐时多重比较采用LSD检验法,方差不齐时多重比较采用Dunnett’s T3检验法,显著性水准a取0.05,双侧。结果1吉非替尼下调博莱霉素致肺纤维化小鼠的上皮-间质转分化1.1各组小鼠肺组织病理评分差异有统计学意义(F=38.750,P<0.001)。对照组小鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,肺间质无炎症细胞浸润。BLM组小鼠各肺叶均存在弥漫性的肺泡间隔增厚与肺泡壁破坏,肺间质炎症细胞浸润与出血,血管床不同程度破坏。BLM+Ge组小鼠在肺泡结构、血管床破坏程度和炎症细胞浸润方面均较轻。BLM组小鼠肺组织病理损伤评分显著高于对照组(n=5,P<0.001),吉非替尼处理后,小鼠病理损伤评分较BLM组明显降低(n=5,P<0.01)。1.2各组小鼠肺组织纤维化评分有统计学意义(F=31.971,P<0.001)。对照组肺组织结构完整清晰,未见明显炎细胞浸润、胶原沉积。BLM组小鼠肺组织结构紊乱,肺间质可见渗出、炎细胞浸润,大量蓝色胶原沉积。BLM+Ge组小鼠气道上皮下出现少量炎细胞浸润,肺泡间隔稍增厚,但结构基本完整,少量蓝色胶原沉积。BLM组小鼠肺组织纤维化评分显著高于对照组(n=5,P<0.001),吉非替尼处理后,小鼠纤维化评分较BLM组明显降低(n=5,P<0.01)。1.3各组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=23.607,P<0.001)。BLM组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001)；BLM+Ge组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P=0.001)。1.4各组小鼠肺组织α-SMA蛋白含量差异有统计学意义(F=7.581,P<0.05)。BLM组小鼠肺组织α-SMA明显增加(n=4,P<0.01);BLM+Ge组小鼠肺组织a-SMA明显降低(n=4,P<0.05)。1.5各组小鼠肺组织E-Cadherin蛋白含量差异有统计学意义(F=13.561, P<0.01)。BLM组小鼠肺组织E-Cadherin明显降低(n=4,P=0.001);BLM+Ge组小鼠肺组织E-Cadherin明显增加(n=4,P=0.01)。1.6各组小鼠肺组织Fibronectin蛋白含量差异有统计学意义(F=31.726,p<0.001)。BLM组小鼠肺组织Fibronectin明显增加(n=4,p<0.001);BLM+Ge组小鼠肺组织Fibronectin明显降低(n=4,P<0.001)。2吉非替尼下调博来霉素致肺纤维化小鼠TGF-p通路2.1各组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=23.607,P<0.001)。BLM组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001)；BLM+Ge组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P=0.001夕。2.2各组小鼠血清中TGF-β1浓度差异有统计学意义(F=14.391,P=0.001)。BLM组小鼠肺组织TGF-β1明显增加(n=5,P<0.001)；BLM+Ge组小鼠肺组织TGF-β1明显降低(n=5,P<0.01)。2.3各组小鼠肺组织Erk蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=12.78,P<0.01)。BLM组小鼠肺组织Erk蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001)；BLM+Ge组小鼠肺组织Erk蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P<0.05)。2.4各组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=17.7,P=0.001)。BLM组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001);BLM+Ge组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P<0.05)。3TGF-p与EGFR/Akt两通路在肺纤维化小鼠模型上皮-间质转分化间的相互作用3.1各组小鼠肺组织病理评分差异有统计学意义(F=80.987,P<0.001)。对照组小鼠肺泡结构清晰,肺泡壁薄,无明显充血及细胞浸润。BLM组小鼠肺组织大面积实变,小鼠肺泡结构亦大面积实变,肺泡间隔增厚,肺泡内出血,炎细胞浸润。BLM组小鼠肺组织病理损伤评分显著高于对照组(n=4,P<0.001),TGF-βRI抑制剂(Ly364947)处理后,小鼠病理损伤评分较BLM组增高,差异无统计学意义(n=4,P>0.05)。3.2各组小鼠肺组织纤维化评分有统计学意义(F=39.328,P<0.001)。对照组肺组织结构完整清晰,未见明显炎细胞浸润、胶原沉积。BLM组小鼠肺组织结构紊乱,肺间质可见渗出、炎细胞浸润,大量蓝色胶原沉积。BLM+Ly组小鼠气道上皮下出现大量炎细胞浸润,肺泡间隔增厚,基本肺泡结构消失,大量蓝色胶原沉积。BLM组小鼠肺组织纤维化评分显著高于对照组(n=4,P<0.001),TGF-βRI抑制剂处理后,小鼠纤维化评分较BLM组增高,差异无统计学意义(n=4,P>0.05)。3.3各组小鼠血清中TGF-β1浓度差异有统计学意义(F=5.446, P<0.05)。BLM组TGF-β1浓度较对照组升高,差异有统计学意义(n=4, P<0.001)。BLM+Ly组TGF-β1浓度均较模型组稍降低,差异无统计学意义(n=4,P>0.05)。3.4各组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平含量差异有统计学意义(F=15.351,P=0.001)。BLM组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平明显增加(n=4, P<0.001); BLM+Ly组小鼠肺组织Smad2/3蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P<0.01)。3.3各组小鼠肺组织c-Src蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=25.950,P<0.001)。BLM组小鼠肺组织c-Src蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001)；BLM+Ly组小鼠肺组织c-Src蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P<0.001)。3.5各组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平差异有统计学意义(F=26.559,P<0.001)。BLM组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显增加(n=4,P<0.001)；BLM+Ly组小鼠肺组织EGFR蛋白磷酸化水平明显降低(n=4,P<0.001)。结论1.下调EGFR活性,可抑制肺纤维化小鼠上皮-间质转分化。2.吉非替尼抑制EGFR活化能够抑制Erk活性,阻断TGF-/βSmad通路活化,从而抑制肺纤维化EMT。3.TGF-β信号可能通过活化c-Src从而激活EGFR通路,在博来霉素致小鼠肺纤维化中,EGFR和TGF-β/Smad通路存在正反馈环路,共同促进肺纤维化发生发展。