受限于人体组织有限的再生修复能力，骨缺损的修复重建一直是骨科的一大难题。近年来，组织工程技术的逐渐兴起为克服这一难题提供了有效的解决策略，然而组织工程骨的血管化问题成为限制其发挥生物学效能的一个“瓶颈”。血管内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)具有在体外形成内皮样克隆与促进体内血管生成(Angiogenesis)的能力，有可能被用于解决血管化这一“瓶颈”问题。骨是一种高度血管化的组织，而血管生成是骨再生修复过程中一个至关重要的基本环节。国内外许多研究证实：EPCs可以通过增强骨修复过程中的血管生成与骨形成能力来促进骨缺损修复。然而，目前绝大多数的研究都只聚焦于EPCs对骨形成(boneformation)的促进效果，而基于EPC的血管生成对骨缺损修复的促进机制却未被进一步阐明。骨缺损修复重建是由多种细胞、因子以及细胞外基质共同参与的一个复杂、连续的生物学过程。而在这一过程中，行使骨吸收功能的破骨细胞与行使骨形成功能的成骨细胞发挥着重要作用。在骨缺损修复重建的早期，破骨细胞吸收陈旧或坏死的骨组织，为成骨细胞及其前体细胞的进入与新骨的形成创造空间。而在骨缺损修复重建的晚期，骨组织开始持续的重建塑形，这一过程也是通过破骨细胞的骨吸收活动以及成骨细胞的骨形成活动来实现的。EPCs是内皮细胞的前体细胞，可以看作是代表血管生成活动的细胞模型；破骨与成骨前体细胞作为破骨与成骨细胞的前体细胞，分别代表着破骨与成骨活动。探索这三种前体细胞之间的相互作用，将有助于进一步理解EPCs在骨缺损修复重建中的作用及其机制。为探讨EPCs在骨缺损修复重建中的作用及其机制，本研究首先通过分离、培养、鉴定小鼠骨髓源的EPCs，并建立小鼠EPCs与RAW264.7单核细胞（作为破骨前体细胞）非接触式共培养体系以研究EPCs对破骨前体细胞体外生物学行为的影响；接下来，我们从兔骨髓中分离培养EPCs与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)并进行细胞鉴定，然后进一步研究EPCs共培养对MSCs存活、分化等体外生物学行为的影响。随后通过将EPCs与MSCs共接种于脱钙骨基质(Demineralized bone matrix, DBM)上作为预血管化组织工程骨，并将预血管化组织工程骨植入兔桡骨骨缺损处，用以研究EPCs预血管化组织工程骨在促进骨缺损修复重建过程中是否有助于新生骨组织结构的重建与功能的恢复。方法及结果：1.采用Percoll密度梯度离心法从C57/BL6小鼠骨髓中分离单个核细胞，经诱导培养获取EPCs并体外扩增，然后通过流式细胞检测、免疫双荧光标记以及免疫组织化学等手段对EPCs进行鉴定。利用Transwell小室(孔径3.0um)将小鼠EPCs与破骨前体细胞RAW264.7细胞株进行非接触式共培养，并通过CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒检测EPCs对RAW264.7细胞存活的影响。利用孔径为8.0um的Transwell小室进行Transwell迁移实验，观察EPCs对RAW264.7细胞的迁移能力的影响。为了观察EPCs对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响，将共培养组与阴性对照组(RAW264.7细胞，无其他的处理)以及阳性对照组(RANKL+M-SCF诱导培养)进行对比。通过比较共培养组、阴性对照组以及阳性对照组中类破骨细胞(TRAP染色阳性，细胞核≥3)的数目，结果显示EPCs共培养组中的类破骨细胞数显著高于阴性对照组，但仍低于阳性对照组，提示EPCs能促进破骨前体细胞向破骨分化。这些结果表明，EPCs可以促进破骨前体细胞存活、迁移与分化等生物学行为。进一步分析，EPCs可通过分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多种细胞因子，并通过影响Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多条信号通路参与调控RAW264.7细胞的生物学行为。2.采用Percoll密度梯度离心法分离兔骨髓中的单个核细胞并进行体外诱导培养，分别获得兔骨髓源的EPCs和MSCs。将两种细胞分别进行培养与鉴定，并将EPCs和MSCs按2:1，1:1，1:2三种不同比例进行细胞接种共培养，确定MSCs与EPCs的最佳细胞共接种比例为1:1。随后按1:1的比例将MSCs与EPCs进行共培养，研究EPCs对MSCs存活与分化等生物学行为的影响，发现EPCs可以提高MSCs的体外存活能力，并促进MSCs向成骨方向分化。此外，按1:1的比例将MSCs与EPCs共接种于DBM支架材料上以构建预血管化组织工程骨，评价EPCs/MSCs共接种对组织工程骨细胞上架率的影响，结果显示EPCs/MSCs共接种组的细胞上架率显著高于MSCs单一接种组，提示共接种可以使组织工程骨获得更高的细胞上架率。3.于兔双侧桡骨中段各截取一15mm的骨段以制备兔桡骨骨缺损模型。24只新西兰大白兔，共计48处骨缺损，随机分为三组：预血管化组植入EPCs/MSCs共接种的预血管化组织工程骨，普通TEB植入MSCs单一接种的组织工程骨，对照组植入无任何的细胞的DBM支架材料。通过影像学、组织形态学等方法观察骨缺损区的血管与骨修复重建的变化，探讨EPCs预血管化组织工程骨对骨缺损修复重建的促进作用。免疫组织组化学结果显示，EPCs预血管化组织工程骨内血管化相关因子(VEGF与VIII因子)的表达在术后早期显著高于其它组的组织工程骨；而骨核素检测进一步证实，术后2-12周预血管化组骨缺损区的血供均显著高于其它实验组，提示EPCs能更早地实现骨内血管循环系统的重建。影像学结果发现，除术后第2周时预血管化组与普通TEB组的评分无显著差异，术后第4-12周预血管化组的影像学评分均显著高于其它各组；术后第12周的墨汁灌注形态学观察以及显微计算机断层扫描(Micro-CT)检测结果显示，预血管化组骨缺损区新生骨组织的髓腔与髓内血管已基本再通，普通TEB组仅部分再通，而对照组髓腔仍处于封闭状态，这表明EPCs预血管化组织工程骨不仅能促进早期骨痂的形成，实现骨缺损区的桥接(bridging)，还可以加速新生骨组织的重建塑形，促进髓腔与髓内血管更早地实现再通。骨密度检测与生物力学测试结果显示EPCs组的骨密度与力学强度均显著高于其它各组，提示EPCs预血管化组织工程骨除了可以促进早期血管化与缺损区组织修复，还可以促进骨力学性能的恢复，实现骨结构与功能的共同恢复，从而最终实现骨缺损的完全修复重建。结论1. EPCs可通过分泌VEGF-A、SDF-1α以及TGF-β1等多种细胞因子，并经过Akt、ERK1/2、P38MARK、Smad等多条信号通路促进RAW264.7细胞存活、迁移以及分化等生物学行为。2. EPCs可以促进MSCs存活与分化，其中细胞共接种比例为1:1时MSCs的细胞存活能力最强。3. EPCs与MSCs共接种方法优于MSCs单一共接种法，可以显著提高组织工程骨的细胞上架率。4.基于EPCs的预血管化策略能促进组织工程骨在体内更早地实现血管化，以恢复骨缺损区的血供。5. EPCs的预血管化策略不仅加速了骨缺损区的组织修复，同时也能促进骨的重建塑形，以恢复骨的形态结构以及功能特性。