研究背景:自闭症（Autism Spectrum Disorder,ASD）是一类以社会交互能力损害,兴趣狭窄和限制与重复刻板样行为为主要特点的临床征候群,发病率逐年升高。运动障碍是自闭症患者中最常见的合并症之一,包括震颤、共济失调、运动失能、肌张力障碍等。对于社会交流与社会适应能力已经受损的自闭症患者,运动障碍进一步限制了其生活独立性及生活质量。另外,运动影响高级认知行为,在语言交流、情感控制、执行能力、运动行为控制等方面发挥重要的作用,因此运动障碍可能参与自闭症行为的发生。小脑位于大脑半球后方,是相对独立的神经中枢,同时也是调节运动功能的重要脑区。小脑结构异常及其引起的功能障碍在临床自闭症患者和模型小鼠中得到广泛证实,因此,小脑亦是自闭症病理发生机制研究的一个重要脑区。研究小脑发育异常引起运动障碍发生发展的病理过程,有助于从运动障碍的角度理解自闭症的病理发生机制。小脑具有典型的三层板层样结构,包括分子层（Molecular Layer,ML）、蒲肯野细胞层（Purkinje Cell Layer,PCL）以及内颗粒层（Inner Granule Layer,IGL）。小脑的发育主要在生后早期完成,人类小脑发育在两岁内逐步完善,而小鼠则在2周内基本完成小脑的发育。小脑发育过程中,数十亿计的颗粒神经元由小脑外颗粒层（External Granule Layer,EGL）中的颗粒神经元前体细胞（Granule Cell Precursors,GCPs）增殖产生,随后沿着伯格曼细胞的放射状纤维向内迁移,到达IGL后形成成熟颗粒神经元。在此过程中,颗粒神经元发出平行于小脑皮层的“T形”纤维,穿行于分子层中,并与蒲肯野细胞向上生长到达ML中的树突形成突触联系。蒲肯野细胞的胞体则向下发出轴突联系至小脑深部的核团,并经此中转投射至更广泛的大脑区域。当所有的颗粒神经元完成迁移后,EGL消失,蒲肯野细胞也基本发育完善,由此形成小脑的三层板层结构。板层结构形成的过程中,小脑皮层特定部位颗粒神经元增殖速度变快,并通过蒲肯野神经元轴突的锚定向内牵引,小脑皮层在该部位形成向内的凹陷。随着小脑皮层向外地发育,逐渐形成了小脑的叶片状结构。在小脑发育的关键期,关键细胞学事件发生异常会导致小脑叶片和板层结构发育异常,进而引起神经网络形成的受阻及神经活动的异常。蒲肯野细胞是小脑内唯一的传出神经元,研究者在自闭症患者和模型小鼠中发现蒲肯野细胞的病理学改变和功能异常,并且这与自闭症患者中运动障碍行为的出现高度关联,然而其潜在的机制目前仍不明确。BTBR T⁺Itpr3^tf/J（BTBR）小鼠是目前应用非常广泛的一种特发性自闭症模型小鼠,携带了Disc1^del、T⁺、Itpr3^tf、Cox7a2l^l突变基因,从而表现出自闭症的一系列症状,包括社交功能障碍、重复刻板样行为等核心症状。近期的研究发现BTBR小鼠同时表现出感觉运动异常及空间感知异常,并且倾向于过度活跃及冲动行为。此外,在BTBR小鼠中亦观察到小脑中免疫、氧化应激等相关改变,而Haijie Yang在研究中发现BTBR小鼠小脑叶片异常增多。然而BTBR小鼠运动功能障碍是如何发展并影响自闭症行为,小脑发育参与运动功能障碍的途径和细胞学机制均需进一步阐明。在本研究中,我们进一步探索并明确了BTBR小鼠的肌张力障碍样行为和注意力缺失样行为。同时,我们发现BTBR小鼠生后小脑神经发生异常,并影响了叶片形成和蒲肯野细胞发育,这些发育关键期出现的细胞学事件异常可能与其运动障碍行为相关。研究方法:小鼠出生后3天（Postnatal day 3,P3）至P150通过悬尾实验连续观察比较BTBR小鼠及野生型（Wild Type,WT）小鼠肌张力障碍样行为。P14至P150通过金属网格悬挂实验观察比较BTBR小鼠及WT小鼠肢体协调能力及抓握能力。小鼠成年后（8周）通过水平爬梯实验、加速转棒实验及旷场实验观察比较BTBR小鼠及WT小鼠精细运动能力、运动学习能力、运动协调能力及整体运动性。分别收集P3、P7、P14及成年期（3月龄）BTBR小鼠及WT小鼠小脑标本,通过比较BTBR小鼠及WT小鼠小脑HE染色结果,观察BTBR小鼠小脑大体形态改变及其发育进程。通过BrdU及Ki67免疫荧光染色观察P3、P7时BTBR与WT小鼠GCPs增殖情况,NeuN免疫荧光染色、尼氏染色及HE染色观察颗粒神经元迁移进程及成熟颗粒神经元异位情况,GFAP及S100β免疫荧光染色观察P7时BTBR小鼠及WT小鼠伯格曼胶质细胞发育情况,CB免疫荧光染色及免疫蛋白印迹观察P14时BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野细胞的发育。通过高尔基染色观察P14时BTBR小鼠及WT小鼠蒲肯野细胞树突形态、树突棘数量及分型。通过GAD67及vGlut1免疫荧光染色及免疫蛋白印迹观察成年期BTBR小鼠及WT小鼠小脑兴奋性及抑制性神经递质表达情况。最后,在P14时收集BTBR小鼠及WT小鼠新鲜小脑样本,通过全转录组测序及实时荧光定量PCR技术,比较BTBR小鼠和WT小鼠小脑差异表达基因,并通过通路富集及蛋白互作分析以深入探索BTBR小鼠小脑异常发育及成年期BTBR小鼠运动障碍及异常行为表型的可能机制。研究结果:1、BTBR小鼠的运动障碍表型（1）悬尾实验中,成年期BTBR小鼠出现严重的肌张力障碍样行为,与WT小鼠相比较,BTBR小鼠后肢明显屈曲过度、双后爪及前后爪异常交错握爪、躯干过度扭转以及过度伸展。（2）悬尾实验追踪观察,BTBR小鼠肌张力障碍样行为出现在P10,随后其发病率逐渐上升,P14时90%的BTBR小鼠均出现肌张力障碍样行为,之后一直维持在该水平持续至成年期。（3）金属网络抓握实验中,在P21时,与WT小鼠相比较,BTBR小鼠抓握时间即掉落潜伏期明显缩短,之后至P150 BTBR小鼠掉落潜伏期持续下降并一直显著低于WT小鼠。（4）爬梯实验中,与WT小鼠相比较,成年期BTBR小鼠在规则模式及不规则模式其爪掉落总次数均显著增加,爬梯穿越时间则显著减少。（5）旷场实验中,与WT小鼠相比较,成年期BTBR小鼠其总运动路程及中央运动路程均显著增加,平均运动速度在第一个5分钟阶段显著增加。（6）加速转棒实验中,成年期WT小鼠第二天掉落潜伏期则相比第一天出现显著提升,之后三天提升更加明显,而成年期BTBR小鼠直至第五天时才相比第一天出现显著差异,BTBR小鼠与WT小鼠相比较,其运动学习能力显著更差,同时BTBR小鼠转棒运动学习过程中出现注意力缺失样行为。2、BTBR小鼠生后发育关键期小脑的异常神经发生（1）成年期小脑组织切片DAPI染色结果显示:BTBR小鼠小脑矢状切面面积较WT小鼠显著增大,主要为内颗粒层及分子层面积增大,BTBR小鼠小脑叶片平均数量较WT小鼠显著增多。P14时,BTBR小鼠小脑的重量较WT小鼠显著增加,且BTBR小鼠P14时小脑占大脑的质量百分比较WT小鼠明显增加。生后小脑发育关键期HE染色结果显示:BTBR小鼠与WT小鼠小脑叶片数量在P3时无明显差异,P7及P14时显著增多;BTBR小鼠小脑矢状切面面积较WT小鼠在P3、P7及P14时均显著增大,BTBR小鼠小脑矢状切面周长较WT小鼠在P3、P7及P14时均显著增加。（2）生后一周,小脑GCPs快速增殖并分化为颗粒神经元,BrdU和Ki67免疫荧光染色用于分析GCPs的增殖。在P3时,小脑BrdU免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠外颗粒层厚度较WT小鼠显著增厚,外颗粒层中BrdU密度、总数量及其占总细胞百分比均显著增加。Ki67免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠小脑外颗粒层Ki67免疫反应阳性细胞较WT小鼠在P3与P7时均显著增加。（3）P7时Neu N免疫荧光染色结果显示:NeuN标记的成熟颗粒神经元主要位于内颗粒细胞层,BTBR与WT小鼠小脑的外颗粒细胞层与分子层中均未观察到NeuN标记的异位神经元,DAPI染色显示两组间外颗粒层厚度无显著差异。HE染色中,分子层中梭形核可以标识迁移的颗粒神经元,我们发现P7时,BTBR小鼠分子层中梭形核数量较WT小鼠显著增加,但其百分比即迁移率无明显差异。小脑中的伯格曼胶质细胞胞体主要位于蒲肯野细胞层,伯格曼胶质纤维引导颗粒神经元的迁移,其胞体和放射状纤维可以用S100β和GFAP分别进行特异性标识。P7时S100β及GFAP免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠与WT小鼠相比较,小脑伯格曼细胞胞体数量及纤维密度均无明显差异。成年期小脑尼氏染色显示:BTBR小鼠分子层及颗粒层中成熟颗粒神经元数量及分布较WT小鼠无明显区别。以上结果提示BTBR小鼠小脑颗粒神经元的迁移以及伯格曼胶质细胞的发育均未受显著影响。（4）P14时,BTBR及WT小鼠小脑CB免疫荧光染色标记的蒲肯野细胞其胞体呈单层排布,树突位于分子层。BTBR小鼠小脑各叶片蒲肯野神经元密度与WT小鼠相比较无明显差异,而在叶片Ⅳ/Ⅴ、Ⅵ/Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野神经元胞体横截面积较WT小鼠显著变小。蛋白印迹分析结果显示P14时BTBR小鼠小脑CB蛋白相对表达量较WT小鼠显著减少。成年期小脑CB免疫荧光染色结果显示:BTBR小鼠小脑叶片Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ中蒲肯野细胞密度较WT小鼠显著降低。（5）高尔基染色结果显示:P14时BTBR小鼠小脑内蒲肯野细胞树突覆盖面积、主树突长度及树突复杂程度sholl分析与WT小鼠相比较无明显差异,但是BTBR小鼠蒲肯野细胞树突棘密度较WT小鼠显著增加。根据树突棘的形态进行亚型分析,我们进一步发现BTBR小鼠蒲肯野细胞树突棘细长未成熟型较WT小鼠显著增多,而中间短粗型树突棘及成熟蘑菇状树突棘则较WT小鼠显著减少。（6）小鼠成年期,GAD67与CB免疫荧光双标染色结果显示:GAD67主要分布于蒲肯野神经元的胞质中,少量存在于树突底部,GAD67与CB间存在明显的双标重合,且WB检测进一步证实成年期BTBR小鼠小脑内GAD67蛋白表达较WT小鼠显著降低。vGlut1与CB免疫荧光双标染色结果显示:vGlut1大部分存在于分子层中的平行纤维,围绕蒲肯野神经元的树突,以及颗粒细胞层中的颗粒神经元中,并且vGlut1蛋白表达检测后发现,BTBR小鼠小脑中vGlut1蛋白表达较WT小鼠显著增加。3、BTBR小鼠生后发育关键期小脑的基因表达调控（1）P14时BTBR小鼠及WT小鼠小脑新鲜送检样本质检结果均较好,组内样本相关性较好,且组间基因表达模式存在一定差异。（2）P14小脑全转录组测序结果显示,BTBR小鼠与WT小鼠相比较共有3992个差异表达基因,其中1858个为上调表达基因,2134个为下调表达基因。（3）差异表达基因KEGG通路富集分析中,BTBR小鼠与WT小鼠相比较共有23条改变通路,其中涉及谷氨酸能、胆碱能、多巴胺能、γ-氨基丁酸能、5-羟色胺能等各类突触递质相关通路。（4）差异表达基因GO通路富集分析中,BTBR小鼠与WT小鼠相比较在生物过程水平共有16条改变通路,其中多数涉及神经发生,包括神经元分化负性调节、神经系统发育负性调节、神经发生负性调节、细胞生长分化调节、细胞发育负性调节等,而在细胞成分水平则共有50条改变通路,其中涉及很多与突触膜、轴突、突触前、突触后、树突、树突棘等突触成分相关通路。（5）蛋白互作分析中,改变较大及互作联系较多的基因主要为下调基因Dynlt1b、Draxin、Rbpj及上调基因Nog、Trpc6、Bdnf,经实时荧光定量PCR验证发现BTBR小鼠较WT小鼠这些基因均有显著改变且与测序结果一致。其中Trpc家族在小脑发育过程中发挥重要作用,而BTBR小鼠较WT小鼠Trpc家族相关Trpc4基因及Trpc6下游CamkⅣ基因表达显著上调,Trpc3基因表达显著下调。研究结论:BTBR小鼠有明显的肌张力障碍样行为、注意力缺陷样行为、多动样行为、运动协调能力下降、精细运动损害及运动学习能力下降等运动障碍,这些运动障碍可能与BTBR小鼠小脑发育关键期异常的小脑神经发生相关,包括叶片形成异常、颗粒神经元前体细胞异常增殖、蒲肯野神经元发育异常及突触联系异常,而究其原因可能是发育期BTBR小鼠基因表达调控模式的改变,在发育关键期影响了小脑的神经发生。