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研究背景和目的5-氨基酮戊酸光动力疗法（ALA-PDT）作为一种很有前景的临床治疗手段,已被用于治疗多种与高危人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染相关的疾病,如尖锐湿疣（CA）、鲍温样丘疹病、持续性宫颈HR-HPV感染和宫颈上皮内瘤变（CIN）等。ALA-PDT治疗HR-HPV感染相关性疾病的机制是研究的热点之一。研究表明,光敏剂的亚细胞定位与PDT所激活的信号通路和诱发的细胞死亡方式密切相关。5-氨基酮戊酸（ALA）作为强光敏剂原卟啉Ⅸ（PpⅨ）的前体,进入细胞后主要聚集于线粒体,形成的PpⅨ也主要定位于线粒体。因而目前关于ALA-PDT的机制研究主要聚焦于其对线粒体的影响上,关于ALA-PDT能否对内质网产生影响还少有文献报道。课题组前期的研究表明,ALA-PDT可能通过调节细胞凋亡和自噬来降低CA患者HR-HPV病毒载量。本研究从内质网应激（ERS）相关途径的角度探讨ALA-PDT对HeLa细胞（HR-HPV感染细胞）自噬和凋亡表型的影响及相关信号通路,为更好地将ALA-PDT应用于HR-HPV感染相关疾病的临床治疗提供新的理论支持。方法1.分别用不同浓度的ALA和不同强度的照光能量处理HeLa细胞。细胞存活率采用CCK-8法测定,以均数±标准差表示,计算方法为:细胞存活率=（[ODexperiment-ODblank]/[ODcontrol-ODblank]）× 100%)。选择细胞存活率最接近50%的处理条件作为接下来实验的条件参数。设立不同条件的组别:Control组,ALA组,Light组,ALA-PDT组。在倒置相差显微镜（10×10）下拍摄不同组细胞形态图像。2.免疫荧光检测四组活性氧（ROS）产生情况。免疫印迹法检测各组ERS标志蛋白 CHOP 和 Grp78 及 UPR经典信号通路（PERK-eIF2 α-ATF4,IRE1 和 ATF6）的蛋白表达量并进行定量分析;采用ROS抑制剂NAC预处理后,检测CHOP和Grp78蛋白表达量。采用流式检测各组凋亡水平,免疫印迹法检测内质网特异性凋亡标记物caspase12。3.采用免疫印迹法、共聚焦及免疫荧光法评价自噬相关蛋白LC3、Beclin1的水平及自噬溶酶体数量。4.ALA-PDT处理后,采用流式细胞术检测ALA-PDT处理后胞质内Ca2+水平;采用ERS抑制剂4-PBA或Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理,流式细胞术检测胞质内Ca2+水平。采用免疫印迹法检测ALA-PDT处理后CamKKβ和AMPK活性水平和自噬相关蛋白表达,并分别使用上述二者的抑制剂（STO-609和Com.C）及Ca2+螯合剂BAPTA-AM、ERS抑制剂4-PBA预处理HeLa细胞后检测CamKKβ和AMPK活性水平和自噬相关蛋白表达。5.采用自噬抑制剂预处理,流式细胞术检测ALA-PDT联合自噬抑制剂3-MA处理后Hela细胞凋亡率的变化。结果1.ALA-PDT抑制HeLa细胞的细胞活性,且细胞活性呈ALA浓度和照射剂量依赖性。细胞存活率最接近50%的处理条件为0.25mmol/L ALA处理24h,然后采用1.2 J/cm2的能量照射细胞后再处理24h。无特殊说明时,此条件作为接下来实验的参数。Control组、ALA组和Light组细胞形态正常,贴壁生长,无细胞碎片。低剂量ALA-PDT组（0.25mM,0.6J/cm2）HeLa细胞间隔增加,连接消失。中高剂量ALA-PDT组（0.25mM,1.2J/cm2或2.4J/cm2）HeLa细胞萎缩,间隔增大,粘附力差,可见细胞碎片。2.ALA-PDT处理后HeLa细胞ROS产生增加;ALA-PDT可以激活ERS标志蛋白 GRP78、CHOP 及 UPR 经典信号通路（PERK-eIF2 α-ATF4,IRE1 和 ATF6）;抑制ROS产生可降低ERS标志蛋白CHOP和Grp78的表达量。ALA-PDT诱导HeLa细胞凋亡并促进内质网特异性凋亡标记物caspase12剪切增加,表明ALA-PDT诱导的凋亡包括内质网特异性凋亡。3.ALA-PDT使HeLe细胞LC3 Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1蛋白表达量增加,自噬溶酶体数量增加。4.ALA-PDT使HeLe细胞胞质内Ca2+浓度上调,采用ERS抑制剂4-PBA或Ca2+螯合剂BAPTA-AM预处理,胞质内Ca2+浓度上调水平减少。ALA-PDT处理后,ERS可通过Ca2+-CamKK β-AMPK通路激活自噬,抑制ERS、螯合胞质中Ca2+、抑制CamKK β或抑制AMPK可抑制自噬产生。5.联合自噬抑制剂3-MA可促进ALA-PDT处理后HeLa细胞凋亡率增加。结论ALA-PDT可以促进HeLa细胞发生ERS,ERS的发生建立在细胞出现氧化应激的基础上。ERS一方面可以诱导内质网特异性的凋亡,另一方面可以通过Ca2+-CamKKβ-AMPK通路激活自噬。抑制自噬可促进ALA-PDT的杀伤效果,提高HeLa细胞的凋亡率,表明自噬可能参与了 ALA-PDT抵抗,抑制自噬或与其相关的Ca2+-CamKK β-AMPK通路可能成为提升ALA-PDT治疗HR-HPV感染相关疾病的效果的手段。