【摘 要】
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研究背景心肌纤维化(MF)是众多心血管疾病及心脏老化的一个重要病理特征,最终可导致心功能不全等一系列严重的病理损害,同时也是心血管疾病的主要死亡原因之一,所以寻找抑制心肌纤维化逆转心室重构的新靶点迫在眉睫。低分子量透明质酸(LMW-HA)不仅是纤维化的产物,也可以作为驱动因子刺激纤维化,但其导致心肌纤维化的具体作用机制仍未明确。研究目的研究低分子量透明质酸(LMW-HA)对小鼠心肌成纤维细胞表型转
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研究背景心肌纤维化(MF)是众多心血管疾病及心脏老化的一个重要病理特征,最终可导致心功能不全等一系列严重的病理损害,同时也是心血管疾病的主要死亡原因之一,所以寻找抑制心肌纤维化逆转心室重构的新靶点迫在眉睫。低分子量透明质酸(LMW-HA)不仅是纤维化的产物,也可以作为驱动因子刺激纤维化,但其导致心肌纤维化的具体作用机制仍未明确。研究目的研究低分子量透明质酸(LMW-HA)对小鼠心肌成纤维细胞表型转化的促进作用,以及探讨CD44和S100A4在此过程中的作用。研究方法1、从1-3天龄的SPF级ICR乳小鼠的心脏中分离并提取心肌成纤维细胞(CFs)和心肌细胞(MCs),培养至第三代后进行细胞学实验。2、使用LMW-HA刺激细胞,通过CCK-8和Ed U染色方法检测心肌成纤维细胞的增殖情况,确定LMW-HA的最佳刺激浓度。3、通过WB、q RT-PCR和IF检测LMW-HA刺激后心肌成纤维细胞的表型转化(α-SMA、Collagen III)以及CD44和S100A4的含量变化。4、对心肌成纤维细胞进行质核分离,通过WB和IF检测CD44和S100A4蛋白在胞浆与胞核内的含量变化,明确是否发生核转移。通过免疫共沉淀明确CD44与S100A4在细胞内是否发生相互作用。5、使用细胞膜表面CD44的特异性抑制剂BRIC-235,阻断其与LMW-HA的结合,通过WB、q RT-PCR和IF再次检测上述指标。6、构建小鼠重组腺病毒S100A4-Sh RNA,转染LMW-HA诱导的CFs,通过WB、q RT-PCR、IF和Co IP分析S100A4蛋白和心肌纤维化标志物的变化。研究结果1、CD44和S100A4蛋白在正常ICR乳小鼠心脏组织的CFs和MCs中均有表达,且CFs的表达量明显高于MCs。2、LMW-HA在浓度达到0.2mg/ml时即可刺激细胞增殖,0.8mg/ml时促增殖作用最明显。3、LMW-HA刺激后CFs向肌成纤维细胞转化,心肌纤维化标志物(α-SMA和Collagen III)与S100A4表达增加,CD44表达不变。4、对CFs进行质核分离后发现,CD44和S100A4蛋白在胞浆中的表达量降低,胞核逐渐增加;同时两者在细胞内结合,发生相互作用。5、抑制细胞膜表面的CD44,心肌纤维化标志物(α-SMA和Collagen III)表达显著降低,CD44和S100A4蛋白未发生核转移。6、下调S100A4蛋白使心肌纤维化标志物(α-SMA和Collagen III)表达降低,CD44蛋白转移到细胞核内,但未与S100A4蛋白结合。结论LMW-HA的刺激能够促进小鼠心肌成纤维细胞的分化,该过程是通过与细胞膜表面的CD44结合并促进S100A4转移入细胞核内激活下游通路实现的。阻断LMW-HA与CD44的结合或下调S100A4均可以抑制心肌成纤维细胞的表型转化,降低纤维化程度,因此可能是今后临床治疗心肌纤维化的新靶点。
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