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严重烧(创)伤后早期即可导致心脏、胃肠道等组织脏器的缺血缺氧,其发生发展严重影响伤情转归及预后。缺氧细胞早期即可发生能量代谢障碍,其中线粒体损伤是核心环节。微管在细胞中起着支架作用,同时与线粒体之间存在密切的功能联系。缺氧可以导致微管解聚和线粒体膜通透性增加,影响细胞能量代谢并引发凋亡。动力蛋白作为微管和线粒体之间的桥梁分子,发挥着除货物运输之外的其他作用。前期研究发现,动力蛋白轻链1(DYNLT1)和线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)之间存在共定位和蛋白相互作用,可能是新的线粒体膜通透性调控分子,其低表达可加重线粒体对于缺氧损害的敏感程度,但机制不明。根据前期研究和相关文献报道,缺氧可激活p38/MAPK通路并磷酸化微管相关蛋白,而DYNLT1位点S82的磷酸化可影响动力蛋白形成及其货物输送能力。据此,我们推测:缺氧可能导致DYNLT1的磷酸化,并对微管和线粒体功能产生影响。 本课题旨在研究缺氧时 DYNLT1的磷酸化变化对于微管和线粒体的影响,选取S82位点采用位点突变手段模拟过磷酸化和去磷酸化,观测其对于微管聚合/解聚平衡、线粒体通透性转换、细胞能量代谢的影响,以进一步探明缺氧病理损害的机制以及动力蛋白的结构功能,以期为减轻细胞缺氧损害寻找新靶点。 一、材料与方法 1、首先验证缺氧环境下DYNLT1的磷酸化改变并建立S82位点突变的细胞模型。采用免疫共沉淀(IP)、Western blot法观测缺氧时H9c2和HeLa细胞中DYNLT1的丝氨酸磷酸化程度;在此基础上构建S82位点的磷酸化抗体(anti-phospho-S82),检验不同缺氧程度导致的S82磷酸化变化;通过基因位点突变技术将S82分别突变为谷氨酸模拟过磷酸化状态(S82E)、突变为丙氨酸模拟去磷酸化状态(S82A),包装重组腺病毒(Ad- S82E/ S82A)后分别转染H9c2/HeLa细胞株使其稳定表达,为后续实验建立模拟磷酸化的细胞模型。 2、采用Western blot法定量检测和免疫荧光显微技术的形态学观察,从两方面检验不同程度磷酸化调节的DYNLT1对于缺氧微管结构的影响。首先检测缺氧时胞质内聚合态(Ploymeric)与非聚合态(Monomeric)微管蛋白的含量变化;再利用Ad- S82E/ S82A腺病毒分别转染H9c2/HeLa,对比不同磷酸化修饰的DYNLT1对于缺氧时微管解聚(tubulin定量和镜下微管网状结构观测)的影响。 3、同法建立上述转染细胞缺氧模型后,荧光显微镜下对比观察不同S82模拟磷酸化状态对于线粒体膜通透性mPT的影响。采用酯化钙黄绿素(Calcein-AM)和氯化钴(CoCl2)共孵育的方法检测mPTP的开放情况;采用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)荧光染色法检测线粒体膜电位MMP的变化;Western blot法检测各组Cyt c的漏出。 4、同法建立转染后H9c2/HeLa细胞缺氧模型,检测S82位点突变对于细胞能量代谢的影响: CCK-8法检测细胞活力、各组胞浆ATP含量和生成率。 5、从常氧、缺氧正反两方面论证来探寻可能的S82位点磷酸化信号调节通路:p38/MAPK。首先验证缺氧可激活 p38/MAPK信号通路;采用 p38抑制剂 SB203580检测缺氧时对pS82的抑制作用;通过MKK6重组腺病毒转染从上游激活p38,检测常氧时对pS82表达的上调作用。 二、主要结果与结论 1、缺氧可导致DYNLT1发生磷酸化改变。H9c2/HeLa细胞缺氧0.5h、1h、3h、6h时,均发现 DYNLT1发生了丝氨酸磷酸化,呈早期增强、后期降低的趋势,峰值最早出现在缺氧1h。S82位点的缺氧磷酸化变化与此相同。针对S82位点采用腺病毒转染方法成功设计了S82E/S82A突变,分别模拟过磷酸化和去磷酸化状态。 2、缺氧可破坏微管聚合/解聚平衡使之向解聚倾斜。S82E模拟过磷酸化可加重缺氧细胞的微管解聚,表现为游离微管蛋白增多,微管网状结构排列松散、荧光强度降低;S82A模拟去磷酸化可减轻缺氧导致的微管结构破坏,对于微管结构具有保护作用。 3、缺氧可诱导mPTP开放增加,导致线粒体功能障碍。S82E模拟过磷酸化加重了缺氧后的MMP下降,使mPTP开放和Cyt c从线粒体内漏出增加。 S82A对于缺氧后的mPTP开放有一定的遏制作用。 4、缺氧后线粒体功能障碍直接导致能量代谢障碍。不同磷酸化修饰对胞浆ATP含量未见明显影响,但S82E可降低线粒体ATP合成率,而S82A对线粒体ATP合成率无明显改善作用。 5、实验发现缺氧使p38/MAPK通路激活,抑制p38可下调缺氧时pS82的表达,而激活p38可上调常氧时pS82的表达,说明p38/MAPK通路参与了DYNLT1的S82磷酸化调节。