长牡蛎(Crassostrea gigas) Caspase基因克隆、重组与表达分析

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:liongliong502
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本论文以长牡蛎为研究对象,利用长牡蛎幼虫cDNA文库中的EST信息,克隆到长牡蛎凋亡相关Caspase(CgCASP1),通过RealtimePCR分析了该基因在各幼虫阶段的表达特征以及在成体中的组织分布。在原代细胞水平上检测了CgCASP1基因随细胞培养时间增加的表达变化;利用PDTC及H2O2对原代细胞进行刺激诱导凋亡后,分析了CgCASP1和Relish基因mRNA及蛋白水平的表达量变化;构建了体外重组表达载体,并对重组蛋白进行了分离和纯化与活性检测。主要实验的研究结果如下:利用EST提示信息成功克隆了全长为3613bp的CgCASP1基因cDNA序列,其中包含473bp5’UTR及1526bp3’UTR,开放阅读框长1626bp,编码541个氨基酸。该基因编码的蛋白包含caspase家族经典的保守域P20大亚基和P10小亚基,其中五肽保守序列QACRS突变为QACRG。研究发现了长牡蛎CgCASP1的特有片段,并在cDNA及基因组水平上分别进行了验证;通过realtimePCR分析,发现CgCASP1基因在各幼虫时期均有表达,D型幼虫期最高;而成体中鳃的表达量最高,外套膜与肝胰脏中表达量最低。研究发现随着长牡蛎原代细胞培养时间的增加,CgCASP1基因的表达量相应上调;对原代细胞进行H2O2刺激诱导凋亡后Relish基因mRNA表达并无差异,CgCASP1基因表达量显著上调,提示该基因与细胞凋亡相关;PDTC刺激诱导凋亡后下调了Relish基因mRNA表达量,CgCASP1基因没有明显的表达差异;且PDTC刺激后胞质及胞核内的Relish蛋白量均下调,而H2O2刺激后对Relish蛋白无明显作用。在克隆得到CgCASP1基因cDNA全长的基础上,分别构建原核重组表达载体CgCASPl-pEASY-E2和真核重组表达载体CgCASPl-pT7CFE1-Chis进行体外表达:在原核表达系统中得到了约70kD大小的重组蛋白;在真核表达系统中检测了重组蛋白的活性。本论文通过对长牡蛎凋亡相关基因CgCASPl基因的克隆,初步分析了该基因的序列特征和与细胞凋亡的相关性,可以为深入了解软体动物凋亡机制,以及个体发育、形态发生及内源性免疫方面增添新的认识。
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