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研究背景和意义:黄腐酚(Xanthohumol,XN)是一种啤酒花中特有的多酚黄酮物质,长久以来,啤酒花作为啤酒酿造业中的添加剂赋予啤酒特殊的苦味。近年来黄腐酚因其广泛的生物学功能和在预防与治疗癌症中的作用而备受关注。资料显示,黄腐酚有效抑制多种肿瘤细胞的生长增殖,包括前列腺癌、纤维肉瘤、白血病、结肠癌、乳腺癌和卵巢癌等,然而其作用机制尚不明确。因此,本文以人早幼粒细胞白血病细胞HL-60和大鼠神经胶质瘤细胞NG108-15为主要体外细胞模型,观察并评价黄腐酚对细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬以及细胞副凋亡等方面的影响,深入探讨该化合物的抗癌机制,为黄腐酚开发成功能保健食品及其临床应用提供数据支持和理论基础。研究方法:采用台盼蓝排染法检测不同浓度黄腐酚对细胞增殖的影响;光学显微镜下观察不同浓度黄腐酚处理细胞后细胞的形态学变化;采用Annexin V/PI双染法和免疫荧光法检测黄腐酚处理后的细胞凋亡;应用免疫印迹法(Western blot)检测凋亡相关蛋白(半胱氨酸蛋白酶-3,Caspase-3),细胞自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3-Ⅱ和p62),内质网胁迫蛋白(CHOP和GRP78/Bip),泛素化蛋白,MAPK家族(ERK1/2和p-ERK1/2、p38和p-p38、JNK和p-JNK、c Jun和p-c Jun)等蛋白表达水平的变化;采用相关试剂盒检测黄腐酚对细胞蛋白酶体活性的影响;利用透射电子显微镜和激光共聚焦显微技术分析判断黄腐酚引起的胞质空泡的来源以及胞内LC3-Ⅱ的定位;利用活性氧荧光探针DCFH-DA、线粒体膜电势检测探针JC-1和碘化丙锭PI通过流式细胞术检测黄腐酚处理后细胞活性氧、线粒体膜电位和细胞周期分布的变化。研究结果:第一部分黄腐酚对白血病细胞HL-60增殖的抑制作用和相关机制1.黄腐酚浓度依赖性的抑制HL-60细胞增殖,其IC50值约为11.9μM,且黄腐酚处理后的HL-60细胞内产生大量胞质空泡。2.黄腐酚一定程度上诱导非caspase-3依赖性的细胞凋亡,加入广谱的caspase抑制剂z-VAD-fmk未能逆转黄腐酚引起的细胞死亡和胞质空泡。同时,黄腐酚将HL-60细胞周期阻滞于G1期和G2/M期。3.黄腐酚阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制自噬溶酶体的形成,导致自噬流受阻,加入自噬抑制剂3-MA和Baf A1后对细胞增殖和胞内空泡没有影响。4.黄腐酚诱导HL-60细胞发生副凋亡。胞质空泡(来源于内质网膨胀)对细胞造成不可逆的损伤。黄腐酚引起内质网胁迫,上调内质网胁迫蛋白CHOP和GRP78/Bip的蛋白表达,加入内质网胁迫抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)或新蛋白合成抑制剂CHX可以显著逆转细胞死亡和胞质空泡。p38MAPK信号通路参与调控黄腐酚诱导的副凋亡,加入p38MAPK抑制剂SB203580可以减少细胞死亡和胞质空泡。黄腐酚引起胞内泛素化蛋白的大量积累和蛋白酶体活性下降。同时,黄腐酚诱导活性氧的产生,引起线粒体膜电位的下降。第二部分黄腐酚对神经胶质瘤细胞NG108-15增殖的抑制作用和相关机制1.随着黄腐酚浓度升高,NG108-15细胞存活能力逐渐下降,其IC50值为40μM左右。2.黄腐酚未诱导NG108-15细胞凋亡,黄腐酚作用后NG108-15细胞周期阻滞于G1/S期。3.黄腐酚激活了胞内ERK1/2和p38MAPK信号通路,且ERK1/2信号通路在细胞周期调控和细胞增殖抑制中发挥关键作用。结论:第一部分黄腐酚对白血病细胞HL-60增殖的抑制作用和相关机制1.黄腐酚能够浓度依赖性的抑制HL-60细胞的增殖,其主要作用机制为黄腐酚诱导HL-60细胞副凋亡。黄腐酚诱导的副凋亡依赖于内质网胁迫,新蛋白合成,且p38MAPK信号通路参与调控黄腐酚诱导的副凋亡。2.黄腐酚一定程度上诱导了非caspase-3依赖的细胞凋亡,引起了活性氧的上升,线粒体膜电位的下降和G1期和G2/M期细胞周期阻滞。3.黄腐酚阻断HL-60细胞胞内自噬体与溶酶体的融合,从而有效抑制了自噬溶酶体的成熟,导致自噬流受阻。第二部分黄腐酚对神经胶质瘤细胞NG108-15增殖的抑制作用和相关机制1.黄腐酚通过激活ERK1/2信号通路将NG108-15细胞周期阻滞于G1/S期从而抑制细胞增殖。2.黄腐酚激活p38MAPK信号通路却没有诱导NG108-15细胞凋亡。综上所述,本论文发现黄腐酚具有较强的体外抗肿瘤活性,并且针对不同来源的肿瘤细胞系,抑制肿瘤细胞增殖的作用机制不同,表现出较为明显的细胞特异性。