桦褐孔菌(Inonot us obliquus(Fr.)Pi lat)该菌一般寄生在桦木树上。三萜类化合物是桦褐孔菌主要药理活性成分。三萜类物质是桦褐孔菌重要的次生代谢产物且是衡量桦褐孔菌药效的重要指标之一。从桦褐孔菌三萜生物合成路径来看,法呢基焦磷酸合酶是三萜合成途径中的分支关键酶,它的活性与表达量决定后续产物的积累量。因此,对桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶基因及其表达调控的研究,有利于进一步阐明桦褐孔菌三萜合成途径的分子机制。在GenBank筛选出与桦褐孔菌亲缘较近的物种法呢基焦磷酸合酶的氨基酸序列,通过DNAMAN软件对比找到氨基酸的保守区,设计简并引物。以桦褐孔菌总DNA为模板,经PCR扩增得了一个582 bp的桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶基因特异DNA目的片段。基于获得的特异DNA目的片段,设计特异性引物,利用SEFA-PCR法,扩增桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶基因的5端序列。桦褐孔菌RNA经反转录得到c DNA,以cDNA为PCR模板,利用3’-RACE方法扩增法呢基焦磷酸合酶基因的3’端序列。根据扩增的5’和3’端序列找到其启动子和终止子,在其附近设计特异性引物,以桦褐孔菌DNA和反转录的cDNA为PCR模板,扩增出桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶的DNA(cDNA)全长。桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶基因的DNA全长为1186 bp。c DNA全长为1098 bp,编码365个氨基酸。桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列与同为药用真菌的担子菌的灵芝法呢基焦磷酸合酶氨基酸序列有最高相似度,氨基酸序列同样含有的四个氨基酸保守区。基于桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶氨基酸的系统发育树,桦褐孔菌的法呢基焦磷酸合酶属于I型法呢基焦磷酸合酶(真核状态)。将桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶cDNA序列克隆到表达载体pYF1845中然后导入依赖麦角甾醇的酵母菌株CC25,阳性转化子可以在30℃环境下的SC(-ura)培养基上生长。阳性转化子的发酵液水解特定底物,通过HPLC检测特定水解产物来验证桦褐孔菌的法呢基焦磷酸合酶表达功能。为探究某些微生物代谢物或生境里的一些物质对桦褐孔菌代谢通路的影响。某些未知成分可能对桦褐孔菌的生长和有效物质的积累起到促进的作用,这样可以补充或增强桦褐孔菌的原有的功效。本文研究选取桦褐孔菌宿主桦树皮和桦树的根际土水煎液,茉莉酸甲酯溶液,木麻黄弗兰克氏菌和根瘤菌发酵液为诱导剂。本实验以不同浓度的诱导剂诱导菌丝生长,以菌丝生物量、三萜含量为参考值,筛选出最适合诱导剂及剂量。木麻黄弗兰克氏菌发酵液对菌丝生物量的增加作用最大,根瘤菌发酵液的作用稍弱些,茉莉酸甲酯溶液次之,桦树皮水煎液再次之,桦树根际土水煎液的作用最弱。根瘤菌发酵液对菌丝三萜含量的增加作用最大,木麻黄弗兰克氏菌发酵液的作用稍弱些,桦树皮次之,茉莉酸甲酯溶液再次之.桦树根际土对菌丝三萜的积累起到了明显抑制作用。RT-PCR检测上述在不同培养时间和诱导剂浓度下桦褐孔菌法呢基焦磷酸合酶在mRNA水平的表达差异。桦树皮水煎液、茉莉酸甲酯溶液、木麻黄弗兰克氏菌和根瘤菌的发酵液对法呢基焦磷酸合酶的表达量均有明显的促进作用。然而桦树根际土水煎液对其具有显著的抑制作用。结果证明桦褐孔菌中法呢基焦磷酸合酶表达水平明显与菌丝体三萜量呈正相关。