【摘 要】
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目的:观察骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的外泌体(Exosome,Exos)对激素诱导的股骨头坏死中骨生成的影响,探讨这一过程可能涉及的相关基因及其作用。材料和方法:采用从SFHN大鼠和健康大鼠中分离的BMSCs为研究对象,使用Exosome沉淀试剂盒分离健康大鼠来源的BMSC的Exos,透射电子显微镜和蛋白
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目的:观察骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)来源的外泌体(Exosome,Exos)对激素诱导的股骨头坏死中骨生成的影响,探讨这一过程可能涉及的相关基因及其作用。材料和方法:采用从SFHN大鼠和健康大鼠中分离的BMSCs为研究对象,使用Exosome沉淀试剂盒分离健康大鼠来源的BMSC的Exos,透射电子显微镜和蛋白印迹法(Western-blot)验证Exos;将SFHN大鼠BMSCs随机分为两组:模型组和孵育组,以健康大鼠BMSCs作为对照,三组细胞分别与成脂诱导培养液和成骨诱导培养液共培养,油红O染色法分析三组细胞的成脂分化情况;茜素红染色法评估三组细胞的成骨分化情况;使用Osteogenesis RT2 Profiler PCR Array比较分析模型组及孵育组两组细胞中差异表达的基因(Differentially expressed genes,DEGs),利用DAVID6.8在线软件进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集分析和Gene Ontology(GO)功能富集分析,使用STRING数据库预测分析DEGs编码的蛋白质之间的相互作用关系,采用Cytoscape软件进行PPI网络构建,筛选出目的DEGs;构建慢病毒介导的目的DEGs的si RNA载体转染三组细胞,Western-blot和实时定量PCR法检测细胞转染率;将细胞分别与成脂诱导培养液和成骨诱导培养液共培养,油红O染色法分析细胞的成脂分化情况,茜素红染色法评估细胞的成骨分化情况。结果:透射电子显微镜结果显示从BMSCs获得的颗粒尺寸为100-150nm,分布均匀,且具有完整的膜结构,Western-blot结果显示,获得的颗粒显著表达CD63蛋白。与对照组相比,模型组细胞中脂滴数量明显增加,茜素红染色面积明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组细胞相比,孵育组细胞中脂滴数量明显减少,茜素红染色面积明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。PCR阵列结果显示与模型组相比,孵育组细胞中有20个显著差异表达的基因,其中上调基因有11个,下调基因9个;生物信息学分析结果表明,DEGs主要参与免疫应答,成骨细胞分化和转化生长因子-β/骨形态发生蛋白信号通路;PPI网络提示Sox9明显上调且与蛋白质相互作用密切。Western-blot结果显示与对照组细胞相比,模型组细胞中的Sox9蛋白水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),与模型组相比,孵育组细胞中的Sox9蛋白水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Western-blot和实时定量PCR结果显示与非转染的BMSCs相比,慢病毒介导的Sox9-si RNA转染后细胞的Sox9蛋白及基因表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与非转染的BMSCs相比,转染后的三组细胞中脂滴数量明显增加,茜素红染色面积明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:BMSCs Exos能够促进SFHN的成骨作用。在BMSCs Exos促进SFHN骨生成的过程中,测得20种DEGs,其中11种基因表达上调,9种基因表达下调。这些改变可能与免疫反应改变及BMP/TGF-β信号途径有关。Sox9是调控SFHN成骨过程的关键基因片段,能够促进其成骨作用,并影响BMSC Exos对SFHN的治疗作用。
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