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肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan Recognition Proteins,PGRPs)是昆虫免疫系统中一类重要的模式识别受体,在识别入侵病原物及激活免疫信号通路(Toll和Imd)中发挥重要作用。为探讨PGRPs基因在重要农业害虫小菜蛾(Plutella xylostella)免疫识别高致病性苏云金芽孢杆菌HD73(Bacillus thuringiensis,Bt)等病原微生物中的作用,本研究在测定Bt侵染小菜蛾不同时间后的数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profile,DGE)基础上,利用生物信息学分析了小菜蛾免疫防御Bt侵染的相关基因,探讨了小菜蛾免疫防御Bt侵染的动力学分子机制;运用RT-PCR结合RACE技术克隆了PGRP-LB1和PGRP-LB2基因的cDNA全长序列,在此基础上运用qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)技术研究了Bt侵染后PGRP-LB1和PGRP-LB2基因的时空表达模式;运用饲喂法RNAi技术对PGRP-LB1和PGRP-LB2免疫识别Bt的侵染进行了初步的探索。主要研究结果如下:为探讨小菜蛾免疫防御Bt侵染的动态学机制。本研究基于RNA-Seq技术测定了Bt侵染小菜蛾不同时间(6h、12 h、18h、24h和36 h)后的DGE。以小菜蛾基因组作为背景,比较了分析了Bt侵染小菜蛾6h、12 h、18h、24h和36 h后的差异表达基因。DGE测定结果显示:Bt处理小菜蛾6h时,获得2573个差异表达基因,其中747个上调,1826个下调;免疫相关基因249个,其中5个上调,97个下调。Bt处理12h时,获得1582个差异表达基因,其中1190个上调,392个下调;免疫相关基因249个,其中8个上调,37个下调。Bt处理18h时,获得1036个差异表达基因,其中568个上调,468个下调;免疫相关基因249个,其中7个上调,51个下调。Bt处理24h时,获得3404个差异表达基因,其中2746个上调,658个下调;免疫相关基因249个,其中30个上调,49个下调。Bt处理36h时,获得4396个差异表达基因,其中3877个上调,519个下调;免疫相关基因249个,其中53个上调,53个下调。在这些差异表达基因中,PGRP家族、Spatzle和Toll家族基因表达上调,表达差异显著;Cactus、Imd和relish下调表达差异显著;抗菌肽基因中,只有Lysozyme(Lys)家族表达上调,其次过氧化为酶和超氧化物歧化酶表达上调。以上结果表明PGRP家族在识别Bt侵染及启动Toll信号通路,并结合Lys家族协同免疫防御Bt的侵染。Bt侵染诱导了Toll基因的表达上调以及Imd基因的表达下调,表明小菜蛾免疫防御Bt侵染不仅仅是通过Toll的上调,还有可能是通过Imd、relish通路的下调来增强免疫防御能力。其次9个pgrps中,根据不同处理的rpkm值找到具有明显差异的两个pgrp基因,即pgrp-lb1和pgrp-lb2,与pbs处理6h相比较,pgrp-lb1在6h和42h各有一个小高峰为69倍和35倍,pgrp-lb2在6h和42h各有一个小高峰为309倍和513倍,表明pgrp-lb1和pgrp-lb2在小菜蛾免疫识别bt过程中具有重要作用。为进一步探讨pgrp-lb1和pgrp-lb2的功能。根据pgrp-lb1和pgrp-lb2unigene序列设计引物,通过rt-pcr结合race方法克隆了小菜蛾pgrp-lb1和pgrp-lb2这两个基因的cdna全长序列,其中pxpgrp-lb1基因全长为937bp,完整开放阅读框为594bp,可编码197个氨基酸残基,预测成熟肽分子量为21.197kda,等电点为5.48。pxpgrp-lb2基因全长为772bp,完整开放阅读框为612bp,可编码204个氨基酸残基,预测成熟肽分子量为22.114kda,等电点为7.40,前18个氨基酸具有分泌蛋白信号肽的特征,推测为一种分泌蛋白。序列比对及进化关系分析表明,pxpgrp-lb1和pxpgrp-lb2隶属于pgrp-lb家族。为探讨pxpgrp-lb1和pxpgrp-lb2基因的表达模式和对病原微生物诱导后表达的敏感度。qrt-pcr检测结果表明pxpgrp-lb1和pxpgrp-lb2在小菜蛾mrna水平上具有不同程度的上调表达,且pgrp-lb1在诱导6h时表达量达到最高峰,之后一直减少,在18h有另一个小高峰;对于pgrp-lb2在18h表达量达到最高峰。组织特异性检测结果表明,体壁中,均在48h表达量达到最高峰;在血细胞中也都在48h有一诱导高峰;在中肠中,对于pgrp-lb1基因在18h达到诱导高峰,而pgrp-lb2在48h诱导量才达到最大。在脂肪体中,18h达到表达量最大,而pgrp-lb2在6h表达量达到最大;在马氏管中,两个基因均在48h表达量达到最大,表明两个基因表达存在组织差异性。为探讨pxpgrp-lb1和pxpgrp-lb2在小菜蛾免疫识别bt过程中的作用。本研究成功构建了l4440-gfp、l4440-pgrp-lb1和l4440-pgrp-lb2表达质粒,并将该质粒转入表达宿主菌ht115中,将1×107cfu/ml的表达菌株饲喂小菜蛾二龄幼虫,24h之后,饲喂1×105cfu/ml的bt菌,结果表明小菜蛾死亡率升高,表明通过饲喂可以沉默pgrp-lb基因的表达。综上所述,运用dge明确了小菜蛾免疫bt的相关基因及其表达的动力学,为研究小菜蛾与bt侵染的互作机制提供了靶标免疫基因。成功克隆了小菜蛾免疫bt的关键基因pxpgrp-lb1和pxpgrp-lb2,不仅补充了pgrp家族成员;在此基础上成功构建了饲喂小菜蛾的细菌干扰系统,为研究小菜蛾相关免疫基因的功能提供了新的干扰技术,也为基于小菜蛾免疫系统为靶标的新型细菌杀虫剂的开发提供了理论基础。