肺癌的发病率和死亡率居于恶性肿瘤的首位，其中约80％是非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）。分子靶向治疗被认为是治疗晚期NSCLC的主要方法，而表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor， EGFR）则是目前最主要的靶点，但临床上使用的EGFR靶向药物并非对所有患者都有效， EGFR敏感突变则是药物有效的前提。2011版的NCCN非小细胞肺癌指南中明确指出，晚期 NSCLC患者应先检测 EGFR基因的突变状况，若有EGFR基因敏感突变，优先推荐EGFR-TKI治疗。外周血循环DNA因具备肿瘤细胞DNA的一些特征，并且取材方便、创伤小和能实时检测而成为临床研究的热点。本论文主要分以下两部分内容。　　第一部分，人 EGFR基因突变检测方法的建立。　　目的：建立一种能够快速、敏感、特异、简便检测人EGFR基因突变的方法。　　方法：首先，利用分子克隆技术及Fast Mutagenesis System原理，联合质粒连接、转化构建人EGFR基因的4种野生型和29种突变型质粒，并将构建质粒的测序结果与NCBI数据库的序列进行比对。　　其次，采用Primer Express3.0软件设计人EGFR基因29种突变质粒的ARMS特异性引物及检测目的序列的Taqman水解探针，并经过反复实验筛选、确定，进而确定、优化反应体系及确定判定标准并验证其检测灵敏度、特异性、检测限。　　最后，用所建方法检测100例临床石蜡组织样本的EGFR基因并根据划定的判读标准判读结果，然后与焦磷酸测序结果进行比对，验证该方法的可行性。　　结果：①构建完成的人EGFR基因的4种野生型和29种突变型质粒的序列与NCBI数据库序列完全一致，即完成质粒构建。　　②最终筛选并确定的ARMS引物和Taqman探针能够进行特异性扩增，即PCR产物的电泳结果显示全部为目的大小的条带。已建方法的检测灵敏度、特异性和检测限达到检测要求，最后划定的Cutoff△Ct值见表10。　　③所建方法及确定的判读标准检测100例临床石蜡组织样本得到的结果和焦磷酸测序结果完全一致，该法可行。　　结论：本研究建立的PCR-荧光探针法是一种灵敏、特异、简便的人 EGFR基因突变检测方法，有实用参考价值。　　第二部分，探究所建方法检测外周血 EGFR基因突变临床应用的可行性。　　目的：通过对晚期NSCLC患者的配对组织和血浆中的循环DNA进行EGFR基因突变检测，探究所建方法检测血浆DNA EGFR基因突变临床应用的可行性。　　方法：从50例晚期 NSCLC患者的肿瘤组织和血浆中提取DNA，使用已建的PCR-荧光探针法对其进行EGFR突变检测，评估两样本中基因突变的一致性。　　结果：50例肺癌临床样本，在外周血样本中：检出S768I1例，T790M1例， L858R4例， Ins1例，Del5例，共计突变12例，总突变率为24%；在石蜡组织样本中：检出S768I2例， T790M1例，L858R6例， Del5例，共计突变14例，总突变率为28%；其中有3例组织样本能检测到突变而配对外周血样本不能，有1例外周血样本能检测到突变而配对组织样本不能；两样本EGFR基因突变的一致性为92%。　　结论：血浆循环DNA与相对应的肿瘤组织DNA的EGFR基因突变类型一致性较高，部分NSCLC患者的肿瘤组织难以获得，这种简便且微创地检测血浆循环DNA的方法很有可能取代组织而应用于肺癌EGFR基因突变的诊断，从而指导临床治疗。　　本论文突出之处：本论文将ARMS技术和Taqman技术结合，建立了实验室快速检测人EGFR基因的突变检测方法，而且探究了该法对外周血DNA检测的适用性，为以后临床应用打下了基础。