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异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)是三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)中的关键酶,催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)和还原性辅酶NAD(P)H以及CO2和ATP。IDH作为细胞内的管家蛋白,广泛分布于各类生命体中,在生命活动中发挥着重要的催化和调节作用。1.鲍曼不动杆菌异柠檬酸脱氢酶的功能与结构研究鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为革兰氏阴性条件致病菌,目前是世界医院感染的重要病原菌。基因组序列分析显示,鲍曼不动杆菌包含两条IDH基因编码序列,分别编码418个氨基酸的AbIDH1和745个氨基酸的AbIDH2。本研究全面分析了AbIDH1和AbIDH2的生化特性,AbIDH1中Ser113位点的潜在磷酸化作用以及AbIDH2的晶体结构,为IDH功能与鲍曼不动杆菌致病性的关系研究,以及二聚体IDH与单体IDH的进化关系研究提供了新思路。(1)AbIDH1的酶学特性及其潜在磷酸化作用位点的鉴定本研究克隆了鲍曼不动杆菌AbIDH1基因,并对其进行异源诱导表达与纯化。凝胶过滤层析结果显示AbIDH1的分子量为83.5 k Da,表明AbIDH1为同源二聚体蛋白。Mg2+和Mn2+是AbIDH1最佳的金属离子激活剂,而Co2+、Ni2+和Ca2+对AbIDH1活力有显著的抑制作用。AbIDH1的最适反应p H值约为8.2(Mg2+)和7.5(Mn2+);在Mg2+或Mn2+条件下,AbIDH1的最适反应温度均为45°C。AbIDH1是专一性的NADP+依赖型酶,催化比活力约为39.8 U/mg(Mg2+)和59.8 U/mg(Mn2+)。酶动力学分析表明,AbIDH1对底物ICT的Km值分别为68.9μM(Mg2+)和50.5μM(Mn2+),对辅酶NADP+的Km值分别为18.1μM(Mg2+)和46.6μM(Mn2+)。体外磷酸化实验显示,在大肠杆菌异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶的作用下,AbIDH1可以被磷酸化。质谱检测发现,磷酸化作用发生在AbIDH1的Ser113和Ser22位点。为了进一步鉴定Ser113和Ser22的功能,本研究构建了9个突变体酶。研究发现,S113E、S113D和S113Y突变体酶丧失了全部活力,S113A、S113T和S113G突变体酶的活力显著降低,但是Ser22E、Ser22H和Ser22A突变体酶的活性均未受影响。显然,Ser113是AbIDH1潜在的磷酸作用位点。(2)AbIDH2酶学研究及其结构的解析与改造本研究克隆了鲍曼不动杆菌AbIDH2基因,并对其进行异源表达与纯化。凝胶过滤层析与超速离心分别测定AbIDH2的分子量为189 kDa和156 kDa,表明AbIDH2为同源二聚体蛋白。Mn2+是AbIDH2的最适金属离子激活剂。与AbIDH1不同,Co2+和Ni2+对AbIDH2活力无抑制效应。在Mn2+条件下的,AbIDH2的最适pH值为7.2,最适反应温度为45°C。AbIDH2的热稳定性比较差,当温度高于42°C时,AbIDH2迅速失活。AbIDH2同样是专一性的NADP+依赖型酶。在Mn2+条件下,AbIDH2的催化比活力为25.4 U/mg,对底物ICT和辅酶NADP+的Km值分别为20.6μM和93.7μM,对底物ICT和辅酶NADP+的kcat值分别为39.2 s-1和36.9 s-1。系统发生分析显示,IDH家族可以分为第Ⅰ亚家族、第Ⅱ亚家族和第Ⅲ亚家族。AbIDH2属于第Ⅲ亚家族,是一类新型同源二聚体蛋白,与单体NADP-IDH具有高度的序列相似性。本研究通过X衍射获得了分辨率为3.0(?)的AbIDH2晶体结构。结构显示二聚体AbIDH2主要通过盐键、氢键以及非键相互作用来维持其二聚体化状态。将二聚体界面上的7个氨基酸进行突变,成功的将二聚体AbIDH2改造成单体mono-AbIDH2。酶动力学分析结果表明,mono-AbIDH2具有和二聚体AbIDH2类似的催化活性。结构比对发现,AbIDH2的拓扑结构与第I亚家族的同源二聚体NADP-IDH非常相似,而AbIDH2单个亚基的拓扑结构又与第Ⅲ亚家族的单体NADP-IDH极其相似。综合酶学特性:AbIDH2对底物的亲和性高于第I亚家族的二聚体AbIDH1,但远低于第Ⅲ亚家族的单体IDH;AbIDH2的催化效率略高于二聚体AbIDH1,但远低于单体IDH。因此,以AbIDH2为代表的第Ⅲ亚家族二聚体NADP-IDH可能是单体IDH与二聚体IDH之间尚未被发现的进化中间体。2.酿酒酵母IDH1的Arg148功能研究人细胞质IDH1(HcIDH1)第132位Arg(R132)的突变与肿瘤的发生密切相关。R132突变使IDH丧失了催化异柠檬酸氧化的活性,获得了新的催化α-KG还原的功能。ScIDH1 R148与人细胞质IDH1 R132是同源位点。通过定点突变技术,构建了R148H、R148A和R148E三个突变体酶。与野生型ScIDH1的催化效率相比,R148H、R148A和R148E突变体酶的催化效率分别下降了227倍、500倍和5000倍。R148突变严重降低了ScIDH1的活性,但获得了催化α-KG还原反应的新功能。GC/TOF-MS检测结果证实突变体酶的新催化功能确实将α-KG还原为癌代谢物2’-羟基戊二酸(2’-hydroxyglutarate,2’-HG)。因此ScIDH1 R148突变与人HcIDH1 R132突变具有类似的生物学功能。为了了解R148H突变对酵母代谢的影响,我们构建了Sc::R148H酵母突变株。对野生型酵母及其R148H突变株的蛋白质组进行iTRAQ比较分析,在鉴定的3072个蛋白质中,有75个差异表达蛋白,其中42个蛋白表达上调、33个蛋白表达下调。本文研究了酵母线粒体NADP-IDH(ScIDH1)R148的功能,以及ScIDH1 R148H突变对酵母细胞代谢蛋白质组的影响。蛋白质组的进一步深入研究和分析,将为探究IDH突变与肿瘤发生发展分子机制的关系奠定基础。