马立克氏病(MD)是鸡的一种高度传染性、淋巴组织增生性疾病。该病广泛流行是严重危害家禽的传染病之一。致病因子为马立克氏病病毒(MDV),属α-疱疹病毒,包括1、2、3三种血清型,抗原有血清学交叉反应。MDV常与其它病原混合感染、活苗免疫的干扰以及MD的亚临床感染,加大了该病诊断、鉴别诊断及监测的难度。MD是迄今为止唯一可用疫苗预防的肿瘤性疾病,目前活疫苗免疫仍是预防该病的主要手段,疫苗的质量控制和免疫效果,是成功的预防该病发生的关键。MD疫苗包括单价及多价疫苗,均为活疫苗。不同血清型疫苗毒在鸡体内的复制以及野毒感染的监测是有效控制该病的关键。为解决这一问题,本课题研究建立了鸡MD三种血清型病毒的TaqMan探针双重实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测方法,并将其应用于临床诊断、三价苗的研制及疫苗免疫监测。据已发表三种血清型病毒的特异性基因序列:Meq基因、DNA聚合酶基因、SORF1基因,鸡的管家基因卵铁转蛋白基因,设计并合成四对引物,四条TaqMan探针;将PCR扩增的特异片段分别克隆入T载体,并转化入大肠杆菌DH5a中。鉴定后的重组质粒,作为阳性标准品用于双重FQ-PCR的建立。进行FQ-PCR扩增,获得了标准曲线,并进行了该方法的敏感性、特异性、重复性试验研究,初步建立了MDV的双重FQ-PCR检测方法。在国内首次将建立双重FQ-PCR方法应用于临床检测,并与琼脂扩散试验(AGP)和PCR结果相比较。FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP,达100﹪;该方法的灵敏度比常规PCR高10-100倍,在单位细胞内可灵敏地检测到2.01-2.78个拷贝的病毒。第一次将该方法应用于MD三价苗的研究,确定了制备疫苗时三种血清型病毒的有效接种范围、最佳接种剂量及单位蚀斑的病毒载量。应用FQ-PCR对单价苗、三价苗在鸡体内的增殖进行免疫监测。本试验在国内首次建立了MDV双重FQ-PCR检测方法,在量化的标准上对鸡体内的疫苗毒和强毒予以区别,可作为MD特异性诊断标准。具有特异性强、敏感性高、可在1.5-2h内快速完成检测的特点。试验成功地鉴别出三种血清型病毒,研究三种血清型病毒的体外增殖规律,为确保疫苗的质量提供良好的依据,也为多价苗生产提供了可靠而快速的产品检测和质量控制手段。可动态定量地监测病毒在鸡体内的增殖情况,为疫苗的免疫效果评估提供了有效的方法,也为深入研究疫苗免疫机制提供了一条可行途径。