【摘 要】
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2019年末爆发的新型冠状病毒被国际病毒委员会（ICTV）命名为SARS-Co V-2。本次爆发的新型冠状病毒（SARS-Co V-2）较以往的冠状病毒,如严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）表现出更高的感染性和隐蔽性。由新型冠状病毒感染所致疾病被世界卫生组织（WHO）宣布为全球大流行疾病。新型冠状病毒是单链RNA病毒,在复制传代的过程中容易积累自然突变,这些自然突变随着时间
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2019年末爆发的新型冠状病毒被国际病毒委员会（ICTV）命名为SARS-Co V-2。本次爆发的新型冠状病毒（SARS-Co V-2）较以往的冠状病毒,如严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）表现出更高的感染性和隐蔽性。由新型冠状病毒感染所致疾病被世界卫生组织（WHO）宣布为全球大流行疾病。新型冠状病毒是单链RNA病毒,在复制传代的过程中容易积累自然突变,这些自然突变随着时间的推移和在人类寄主中的适应性选择,导致各种突变株不断涌现。其中一些突变株与野生型相比表现出更强的传染性和致病性。含D614位点突变的Delta突变株是截至目前传染性和毒性最强的突变株之一。开发快速有效的核酸检测对新冠病毒高危突变株及其特征性点突变位点进行鉴定是阻断疾病流行的重要手段。本研究拟利用连接酶检测反应（LDR）技术为核心,建立一种能在恒温条件下快速鉴定新冠病毒主要突变株特异突变位点的核酸检测体系。我们首先建立了LDR的基本反应体系,结果表明,该方法对5 pmol/L以上且长度大于40nt的病毒RNA模板所携带的点突变具有良好的区分度。为了进一步提高该方法灵敏度,我们将原有的连接探针优化为锁式探针,经过最适反应条件筛选,使连接酶检测体系的灵敏度提高103倍;为进一步缩短检测时间及检测灵敏度,我们将锁式探针连接酶检测体系与CRISPR-Cas12b系统联用,利用荧光信号实现结果读出,最终检测时间缩短至45分钟,且灵敏度最终提升至0.5 fmol/L。综上所述,本研究建立了一种基于连接酶的核酸检测体系,经过一系列条件优化,初步形成了一个不依赖变温仪器快速鉴定新冠病毒突变株特征点突变的核酸检测体系,并且该体系可检测碎片化的RNA模板,最短模板长度可低至50 nt,在RNA模板质量不佳及其他重要SNP检测领域同样具有一定的应用潜质。该论文有图21幅,表20个,参考文献85篇。
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