背景与目的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界第五大最常见的肿瘤。在我国每年新发和死亡患者均占全球总数的54%,发病率占所有恶性肿瘤的第四位,而死亡率占所有恶性肿瘤死亡的第二位,仅次于肺癌。目前HCC的发病率呈不断上升和年轻化的趋势。近年来随着对HCC研究的深入和外科治疗技术的进步,人们对HCC的发生、发展、转移都有了更深的理解和认识,并在此基础上形成了一些对HCC的诊断、治疗以及预防的新策略和新方法,进一步提高了HCC的治疗效果,延长了患者的生存期。然而目前HCC的病死率仍然很高,对HCC的防治仍面临严峻的挑战。HCC治疗效果的真正提高或突破可能还有赖于HCC的基础研究,尤其是对其癌变机制、复发与转移机制等研究的进一步深入与阐明。肝炎病毒(hepatitis virus)的感染是导致HCC的主要因素,在我国以乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)为主,但随着乙肝疫苗的普及应用及卫生条件的改善,HBV感染率持续下降,HBV感染相关性肝癌也相应减少,而丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染相关性肝癌则显著增加。肝炎病毒感染导致肝脏损伤后伴有持续的肝细胞增殖,细胞增殖加速,使肝细胞增殖周期中的调控基因更容易发生随机改变,同时细胞增殖加速也容易使慢性肝病过程中致病因子所导致的DNA突变得以保留并迅速克隆性扩张,最后导致肝癌的发生。80%的HCC归因于慢性HBV或HCV感染相关的慢性肝病,HCC的发病趋势与这两种肝炎病毒感染的变化相平行。但是HBV和HCV导致HCC的机制不同,HBV相关性肝癌(hepatitis B virus related hepatocellular carcinoma,B-HCC)及HCV相关性肝癌(hepatitis C virus related hepatocellular carcinoma, C-HCC)的临床特征及预后亦有所差别,目前虽然对二者导致HCC的机制、过程等的研究很多,但关于两种不同肝炎病毒引起的肝癌的对比研究仍较少,二者是否有其他方面的差异仍有待进一步研究证实。HCC的发生发展是多基因、多途径、多阶段共同作用的结果,细胞周期调控失常和肿瘤血管生成是其发生发展过程中的两个重要方面。Ki-67是一种核抗原,出现在细胞周期的S、G、M以及G1晚期的细胞核中,是肿瘤细胞增殖过程中最具有代表性的指标之一。而肿瘤细胞的增生活性与肿瘤生物学行为有关。因此,Ki-67可作为判断肿瘤恶性程度及预后的一个生物标志物。在HCC中亦是如此,Ki-67蛋白表达水平越高,肿瘤细胞增殖越快,肿瘤发生侵袭和转移的风险就越高,HCC的恶性程度越高。白细胞分化抗原34(Cluster of differentiation-34, CD34)是一种重糖化工型跨膜蛋白,属于钙黏蛋白家族成员,是所有小血管内皮细胞表达的一种特异性抗原,故除血管起源的恶性肿瘤外,大多数实体肿瘤CD34表达阴性,大量研究表明在HCC癌组织中,可观察到很强CD34染色,着色高密度区多位于肿瘤周边。CD34在肝癌组织的阳性表达提示肝血窦内皮化,并可显示肿瘤内微血管的数量及密度,可以用CD34推算肿瘤的血管,当肿瘤血管丰富时,肿瘤恶性程度高,易出现浸润转移等恶性生物学行为,术后的复发率亦将增高。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是体内最强的一种血管生成因子,它通过与特异性高表达在新生血管内皮细胞表面的受体酪氨酸激酶结合后使受体磷酸化,从而激活一系列信号转导途径,释放各种生长因子和细胞因子,促进肿瘤周围新生内皮细胞的迁移、增殖、生存,最终引起血管增殖,在肿瘤周围血管新生过程中发挥了很重要的作用。研究证实,肝癌组织中的内皮细胞和肝癌细胞表面均存在VEGF受体,且表达的水平明显高于正常组织,距离肝癌组织或转移性肝癌越近的非癌组织中的VEGF表达也越高,肝癌的恶性程度与VEGF的表达呈正相关,VEGF可作为肝癌手术切除后复发的一个标志物。这些分子生物学标志物与HCC的发生、发展及预后相关,分别在HCC形成的各种病理生理机制发挥作用。关于这些分子生物学标志物在HCC中表达的研究国内外均有深入研究,但在HBV、HCV所致肝癌组织中Ki67、CD34、VEGF的表达是否存在差异尚不清楚。因此,本研究采用免疫组织化学法检测Ki-67、CD34、VEGF在B-HCC和C-HCC中的表达,旨在探讨其与肝癌生物学行为的关系以及其三者在B-HCC和C-HCC中的表达的区别,以期为两种不同肝炎病毒引起的HCC的临床、治疗及预后提供有价值的判断指标。方法1.收集2003年12月-2010年10月在南方医科大学附属南方医院行手术治疗的C-HCC标本18例,2011年3月-2012年12月在南方医科大学附属南方医院行手术治疗的B-HCC标本34例。所有标本在离体2小时内均用中性甲醛固定或是先用冰盒冷藏迅速转移至低温冰箱保存。所有组织标本均行石蜡切片,肝癌的病理学诊断均经两名病理学家随机双盲的情况下检查证实确定。2.收集B-HCC和C-HCC的临床病理参数,观察两组患者术后无瘤生存情况,两种不同肝炎病毒引起的HCC的临床病理特征及预后。3.采用免疫组化技术检测所有53例HCC患者的癌组织中Ki-67的表达,分析HCC癌组织中Ki-67的表达与临床病理特征的关系,进一步分析Ki-67在B-HCC和C-HCC中表达的差别。4.采用免疫组化技术检测所有53例HCC患者的癌组织中CD34的表达,分析HCC癌组织中CD34的表达与临床病理特征的关系,进一步分析CD34在B-HCC和C-HCC中表达的差别。5.采用免疫组化技术检测所有53例HCC患者的癌组织中VEGF的表达,分析HCC癌组织中VEGF的表达与临床病理特征的关系,进一步分析VEGF在B-HCC和C-HCC中表达的差别。6.统计学处理：所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料(除术前AFP滴度外)以(x±s)表示,采用t检验；术前AFP滴度用平均秩／秩和表示,采用Wilcoxon秩和检验；四格表资料用百分率表示,采用Fisher精确检验法和x2检验,两独立样本等级资料以百分率表示,采用Mann-Whitney检验。应用Cox回归模型多因素分析预后相关的影响因素。Kaplan-Meier法估计各组患者术后总体生存率。Log-rank法比较患者术后生存的差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.对B-HCC和C-HCC的临床病理特征进行分析结果显示：两组患者的性别构成、发现肝炎到发现肝癌的时间、手术时间、术前AFP水平、肿瘤数目、肿瘤位置、肝硬化比例、分化程度、远处转移间差异无统计学意义(P>0.05)。而B-HCC平均年龄(46.9±10.5)显著低于C-HCC组(59.0±9.9)；平均住院天数(17.9±6.8)显著低于C-HCC组(34.9±16.5)；平均术后住院天数(11.5±4.3)显著低于C-HCC组(19.4±11.9)；肝功能分级中A级肝功明显较C-HCC组多；最大肿瘤直径明显大于C-HCC组,差异均有统计学意义(P<0.05)。B-HCC组患者中位无瘤生存时间为13个月,1年,2年无瘤生存率为56.3%,32.0%;C-HCC组患者中位无瘤生存时间为16.5个月,1年,2年无瘤生存率分别为75%,75%。Cox模型分析提示肝炎类型是HCC术后复发的独立影响因素。B-HCC术后复发的风险是丙肝相关性肝癌的2.35倍(P=0.108)。2.免疫组化检钡Ki-67、CD34和VEGF三种蛋白在B-HCC和C-HCC组织的表达,结果显示：(1) B-HCC组中Ki67阳性表达率为79.4%,明显高于C-HCC组(44.4%),两组间差异有统计学意义(P<0.05);(2) B-HCC组CD34阳性率为79.4%,C-HCC组为88.9%,两组比较差异无统计学意义(X2=0.225, P>0.05);(3) B-HCC组和C-HCC组VEGF阳性表达强度有明显差异(W=350.5,P<0.05),以C-HCC组较强。3.对HCC中Ki67表达与临床病理资料分析结果显示：Ki67在HCC中表达,在患者的性别构成、是否老年人、肿瘤大小、肿瘤数目、肿瘤位置、组织学类型、远处转移上差异无统计学意义(P均>0.05)。但HCC中Ki67阴性者肝功能较差(P=0.037)、有肝硬化比例较大(P=0.014)、HCC分化程度较高(P<0.001),差异有统计学意义。4.对HCC中CD34表达与临床病理资料分析结果显示：CD34的表达均与各临床指标无关(P>0.05)。5.对HCC中VEGF表达与临床病理资料分析结果显示VEGF在HCC中的表达在是否为老年人、肿瘤大小、肿瘤位置、组织学类型、远处转移、肝功能分级、分化程度、肝硬化比例上差异无统计学意义(P>0.05)。但其在男性患者中阳性程度更大(P=0.036),单个肿瘤患者VEGF的表达阳性程度更大(P=0.028),差异有统计学意义。结论B-HCC与C-HCC的临床病理特征及预后有差别,C-HCC以老年患者为主,多伴有术前的肝功能损伤,住院时间及术后住院时间明显较长,而B-HCC多为年轻患者住院时间较短,提示B-HCC术后恢复较快,其原因可能与其患病年龄及术前肝功能相对C-HCC较好有关。而在本研究进行的免疫组化方面,Ki-67的表达程度越高,HCC分化程度越差,癌细胞的增殖活性越强。而在B-HCC组中Ki-67阳性表达率为79.4%,明显高于C-HCC组(44.4%),这提示B-HCC的癌细胞增殖活性较C-HCC强,VEGF在男性患者中阳性程度更大,单个肿瘤患者VEGF的表达阳性程度更大,而B-HCC组和C-HCC组VEGF阳性表达强度有明显差异,以C-HCC组较强。这也提示HCV和VEGF蛋白在HCC的发生发展中存在密切关系。但CD34在两种肝癌中的表达阳性率无明显差异。两种肝癌的以上差异为其相区别的诊治研究提供了新的参考。