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肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)是外科常见的病理生理过程。血液灌流量的减少使肝脏组织发生缺血性损伤,恢复血液灌流后,肝细胞功能代谢及结构破坏反而加重。研究表明,细胞的凋亡和自噬存在于肝脏缺血再灌注过程中,肝脏缺血再灌注后细胞功能代谢障碍加重及结构破坏会伴随着自噬活性的升高。自噬是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统,对细胞的存活是一把双刃剑。生理情况下,细胞维持低水平自噬,通过溶酶体系统对细胞质内大分子物质和细胞器进行降解,促进细胞生存;而在氧化应激、缺血再灌注等病理情况下,过度的自噬可导致细胞功能代谢障碍加重及结构破坏甚至引起自噬性的肝细胞死亡。异丙酚(propofol)是一种烷基酚类的非巴比妥类静脉麻醉药,具有高度脂溶性。因其起效迅速、诱导平稳、苏醒迅速而完全、持续输注后不易蓄积等优点普遍用于麻醉诱导、镇静及麻醉维持。目前认为,异丙酚能减轻缺血再灌注时的肝细胞损伤,改善肝功能、保护肝脏结构。但其保护作用的确切机制尚未完全清楚,可能与其清除氧自由基、抑制脂质过氧化反应、调节钙离子平衡等作用有关。目的本研究探讨了:1.糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)损伤对人肝L02细胞自噬的影响;2.异丙酚对人肝L02细胞OGD/R损伤时自噬的影响,为异丙酚在OGD/R损伤中的肝脏保护作用机制提供实验依据。方法1.体外培养人肝L02细胞,制备糖氧剥夺再灌注损伤(OGD/R)模型,模拟临床的肝脏缺血再灌注损伤。采用随机数字表法将人肝L02细胞随机分为5组:正常对照组(Control组)、糖氧剥夺6h/再灌注1h(OGD6/R1)组、糖氧剥夺6h/再灌注3h(OGD6/R3)组、糖氧剥夺6 h/再灌注6h(OGD6/R6)组和糖氧剥夺6 h/再灌注12h(OGD6/R12)组。随后在倒置显微镜下观察L02细胞形态;采用MTT比色法检测L02细胞的相对增殖情况;免疫印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和P62的表达变化。2.体外培养人肝L02细胞,对细胞进行糖氧剥夺6h再灌12h处理,建立OGD/R模型。根据是否进行OGD/R和是否加入异丙酚(PPF)及加入异丙酚的浓度,将细胞分为正常对照组(Control组)、糖氧剥夺再灌注(OGD/R)组、糖氧剥夺再灌注+异丙酚10μmol/L(OGD/R+PPF10)组、糖氧剥夺再灌注+异丙酚25μmol/L(OGD/R+PPF25)组、糖氧剥夺/再灌注+异丙酚50μmol/L(OGD/R+PP50)组、糖氧剥夺再灌注+异丙酚100μmol/L(OGD/R+PPF100)组。随后在倒置显微镜下观察L02细胞的形态改变;采用MTT比色法检测L02细胞活力;免疫印迹(Western Blot,WB)法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达变化;免疫荧光法检测自噬小体的聚集。3.统计方法采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析,计量资料以均数±标准差(sx±)表示,组间数据的显著性检验采用单因素方差分析,P<0.05确定为有统计学意义,P<0.01确定为有显著统计学意义。结果1.糖氧剥夺再灌注损伤对人肝L02细胞形态的影响与Control组相比,随着再灌注时间的延长,OGD/R组处理L02细胞的形态损伤逐渐加剧,呈时间依赖性。2.糖氧剥夺再灌注损伤对人肝L02细胞增殖活性的影响与Control组比较,随着再灌注时间的增加,L02细胞增殖活性逐渐降低,呈时间依赖性。再灌注1h时,细胞增殖率有所降低(P<0.05);再灌注3h,6h,12h时,细胞增殖率显著降低(P<0.01)。3.免疫印迹法检测糖氧剥夺再灌注损伤对人肝L02细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和P62的表达的影响与Control组比较,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1在糖氧剥夺再灌注1h时即有所增高,随着再灌注时间的延长LC3的表达量逐渐增高并于再灌注6h时大量增加,于再灌注12h时达到最大值(P<0.01);Beclin-1蛋白的表达量随再灌注时间的延长逐渐增加于6h和12h急剧增加(P<0.01);P62蛋白于糖氧剥夺再灌注1h时和3h无明显变化(P>0.05),而在再灌注6h时开始急剧增加,于12h达到最大值(P<0.01)4.异丙酚改善糖氧剥夺再灌注诱导损伤的人肝L02细胞形态正常培养的Control组和PPF组L02细胞形态正常;OGD/R组细胞广泛空泡化,漂浮细胞明增多;较低浓度(10μmol/L,25μmol/L)异丙酚处理细胞,状态改变不明显;中等浓度(50μmol/L)及高浓度(100μmol/L)异丙酚处理后,细胞形态有所改善。5.异丙酚改善糖氧剥夺再灌注诱导损伤的人肝L02细胞增殖活性与Control组和PPF组比较,OGD/R组和OGD/R+PPF(10,25,50,100)各组的细胞相对增殖率显著下降(P<0.01),与OGD/R组比较,较低浓度(10μmol/L,25μmol/L)异丙酚处理后细胞存活率有所增加(P<0.05);给予中等浓度(50μmol/L异丙酚及高浓度(100μmol/L)异丙酚处理后,细胞相对增殖率显著增加(P<0.01)6.异丙酚对糖氧剥夺再灌注诱导的L02细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达的影响与Control组比较,OGD/R组、PPF组和各浓度异丙酚处理组自噬相关蛋白LC3、Beclin-1的表达均上调(P<0.05);与OGD/R组比较,无论是低浓度(10μmol/L,25μmol/L)还是高浓度(50μmol/L,100μmol/L)的异丙酚处理后细胞自噬相关蛋白Beclin-1的均表达下调(P<0.01);而在低浓度(10μmol/L)异丙酚处理后,LC3蛋白无明显变化,提高异丙酚浓度后,其表达下调(P<0.01)。7.免疫荧光法检测自噬小体的聚集Control组与PPF组LC3荧光蛋白在胞浆中呈弥散分布;与Control组与PPF组比较,经OGD/R处理后LC3荧光强度明显增高并呈点状簇集,自噬小体聚集增加;与OGD/R组比较,给予异丙酚处理后L02细胞LC3荧光强度减少,自噬小体聚集减少。结论1.糖氧剥夺再灌注损伤可诱导人肝L02细胞的自噬性死亡;2.异丙酚可通过抑制自噬减轻人肝L02细胞糖氧剥夺再灌注时的损伤,降低细胞死亡率。