论文部分内容阅读
多种骨吸收性疾病，包括骨质疏松，牙周疾病，炎症性骨病，骨转移癌等等，都是破骨细胞功能得到加强，破骨活动强于成骨活动而导致的。成骨细胞／骨髓基质细胞表面的RANKL基因(receptor activator of NF-κB Ligand，核激活因子受体配体)，又称OPGL／ODF(osteoprotegerin ligand／osteoclast differentiation factor，骨保护素配体／破骨细胞分化因子)，是破骨细胞分化和发挥功能的关键基因。RANKL与破骨细胞表面的RANK(receptor activator of NF-κB，核激活因子受体)结合后，刺激破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化，也刺激了成熟破骨细胞发挥骨吸收功能。在RANKL／RANK刺激破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞细胞分化的过程中，破骨细胞前体细胞中的P38 MAP Kinase(P38有丝分裂原激活蛋白激酶，P38 Mitogen-Activated—Protein Kinase)信号途径又起着关键的作用。骨保护素OPG(Osteoprotegerin)是RANKL的假目标受体，可以拮抗RANKL的作用。 在骨转移癌中，肿瘤细胞分泌的甲状旁腺素相关蛋白PTHrP(Parathyroid hormone-related peptide)，通过刺激成骨细胞／骨髓基质细胞高表达RANKL基因，促进破骨细胞的分化，加强破骨细胞的破骨活动，从而导致骨破坏。 我们使用新的水溶性的P38 MAP Kinase信号途径抑制剂Fr167653来研究：1 这种新的P38 MAP Kinase信号途径抑制剂是否能抑制RANKL及PTHrP诱导的破骨细胞形成 2 P38 MAP Kinase信号途径是否参与了骨髓基质细胞中的RANKL及OPG的基因表达 3 建立PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型，研究其血钙水平的变化规律 4 在PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型上，使用Fr167653抑制P38 MAP Kinase信号途径能否抑制PTHrP诱导的骨吸收及高钙血症。由于RANKL在破骨细胞生理学中的重要性，我们也克隆表达了该蛋白，为进一步的研究打下基础。 第四军医大学博士学位论文 一．Fr167653对ILANKL诱导的破骨细胞分化的影响 在巨噬集落刺激因子M—CSF的存在下，RANKL可以直接刺激骨髓细胞中的破骨细胞前体细胞分化成成熟的破骨细胞。在M．CSF存在下，培养鼠骨髓细胞3天后，收集不贴壁及贴壁较为松散的造血细胞（破骨细胞的前体细胞），继续用RANKL刺激3天后，大量的抗酒石酸染色阳性的破骨细胞生成。在加入不同剂量的Fr167653时，即使0．IvM的Fr167653也可以抑制破骨细胞的生成，在10uM的Fr167653的作用下，破骨细胞数目减少更明显。 H．Fr167653对PTHrP诱导的破骨细胞分化的影响 PTHrP可以直接刺激骨髓细胞生成破骨细胞。鼠骨髓细胞在PTHrP的刺激下培养6天，大量的抗酒石酸染色阳性的破骨细胞生成。加入不同剂量的Fr167653培养六天后，计数抗酒石酸染色阳性的破骨细胞数目，0二vM的Fr167653就可以抑制破骨细胞的生成，10P M的Fr167653几乎完全抑制了破骨细胞的生成。 三．Frl67653对贴壁骨髓基质细胞中OPGAtANKL基因表达的影响 收集骨髓细胞培养10大，每两天换液时轻轻吹打移去不贴壁的造血细胞（破骨细胞的前体细胞），贴壁的骨髓细胞为骨髓基质细胞。用PTHrP刺激贴壁的骨髓基质细胞3天和6大，提取RNA，反转录为CDNA后，采用实时荧光PCR检测OPG和RANKL基因的表达。在PTHrP刺激3天和6天时，骨髓基质细胞中的OPG基因低表达，RANKL基因高表达。加入Fr167653，无论是3天还是6天，即使剂量达10 u M，对OPG和RANgy基因的表达都无影响。提示P38 MAP inase信号途径并不参与骨髓基质细胞中OPG和RANM基因的调控。 四．PTHrP诱导的局部骨吸收动物模型的建立 每天注射PTHrP两次，每次9 u g到小鼠的颅骨，分别在3天后的8小时，12小时，24小时以及5天后的12小时取材。通过X线片和组织学检查，在颅骨部位，均产生了不同程度的骨吸收。但是，在注射PTHrP三天后的8小时和12小时，骨吸收虽然产生但不是很显著，至24小时骨吸收明显。在注射五天后，骨吸收非常严重。在注射PTHrP一天后的3小时，三天后的3小时，6小时和10小时，5天后的列、时和10小时，分别检测全血内的血钙水平的变化，发现：注射PTHrP一天不能诱发高钙血症；注射PTHrP3天后产生了明显的高钙血症，高钙血症维持3—6小时后，在10个小时时，成下降趋势；在注射PTHrP 5天后的3个小时有明显的高钙血症，在10个小时后逐渐下降。这提示PTHrP诱导的高钙血症水平并不是恒定的，而是呈波动性变化。局部骨吸收在 3 第四军医大学博士学位论文注射3天后的24小时开始比较明显，在注射PTHrPS大后，可以建立稳定可靠的局部骨吸收和高钙血症动物模型。 五．Frl67653对PTHth体内诱导的骨吸收和高钙血症的影响， 在体外研究中，Frl67653能够抑制RANKL和PTHrP诱导的破骨细胞形成。在体内，Frl67653是否能够抑制破骨细胞活动加强而导致的骨吸收呢？我们利用注射PTHrP到小鼠颅骨建立的局部骨吸收动物模型，研究在动物体内抑制P38 MAP兄nase是否能抑制破骨细胞活