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植物蛋白来源于植物,主要包括大豆蛋白、谷蛋白等,与动物蛋白营养价值相仿,但植物蛋白不含胆固醇,具有多种生理保健功能,在保健食品、健康饮料等领域应用十分广泛,在追求大健康的时代,基于植物基的蛋白食品日益受到青睐。植物蛋白中谷氨酰胺较多,这些酰胺基之间容易形成氢键等结构,从而使得蛋白质发生聚集、沉淀,使其溶解度较低,影响了其在植物蛋白饮料以及其他食品中的应用,因此,需要对植物蛋白的性能进行改性,增强其溶解性,提高其利用率,拓宽其在食品工程中的应用和市场。蛋白质谷氨酰胺酶（Protein-glutaminase,简称PG酶）是一种新型的蛋白质改性剂,它可以作用于多种蛋白质、多肽侧链上的谷氨酰胺基团,发生脱酰胺作用,从而提高蛋白质的溶解性及其它特性,且不会产生交联反应,不会引起蛋白质风味的改变,改性条件温和,特异性高,应用广泛,具有很好的市场潜力。目前,对于PG酶产生菌株的研究较少,PG酶主要来源于解朊金黄杆菌Chryseobacterium proteolyticum,野生菌株发酵产PG酶的能力较差,限制了PG酶的工业化生产和广泛应用。本研究旨在筛选出高产PG酶的野生菌株,不同菌株产生的PG酶性质有差异,对植物蛋白的脱酰胺程度不一样,因此需要挖掘更多的新型产PG酶菌株,并进行鉴定,同时分析不同菌株的PG酶序列,利用原生质体-UV诱变筛选高产菌株、特性菌株,通过优化菌株的发酵条件,提高PG酶产量,为开展PG酶大规模生产和应用奠定基础。本课题主要研究内容如下:1.建立筛选产PG酶菌株的富集培养方法本研究根据菌株的生长特性,确定最优的PG酶生产菌株富集方案是:F富集培养基,10%接种量,培养5天。与现有文献报道的培养9天相比较,本研究的筛选方法富集时间缩短,筛选效率提高。对49份土壤悬液进行富集培养,筛选到72株产PG酶的菌株,其中16株菌株的酶活大于2.0U/m L,文献报道的产PG酶野生菌株的酶活为0.26-0.72U/m L,菌株A4142的酶活为2.15U/m L,是文献报道的最高酶活野生菌株ZYF 120413-7的2.99倍,为生产提供优良菌株。2.鉴定产PG酶的菌株对46株产PG酶的菌株进行鉴定,A4142等42个菌株属于Chryseobacterium proteolyticum,THN1是Chryseobacterium oranimense,T9541是Chryseobacterium sediminis,T15113是Chryseobacterium gleum,4A1是Chryseobacterium cucumeris,共计筛选到5个不同菌种的菌株,酶活在0.38～2.15U/m L。其中,C.oranimense THN1、C.sediminis T9541、C.cucumeris 4A1这3种产PG酶的菌株为本文首次报道,扩大PG酶的菌株来源,丰富了菌种库。3.PG酶鉴定和分析菌株发酵液的SDS-PAGE电泳均能观察到在18.4KD上边有一条条带,与文献报道的PG酶理论分子量19860相一致。通过测定并分析菌株的PG酶序列,结果表明A4142等42株C.proteolyticum与日本文献报道的C.proteolyticum9670T的PG酶蛋白序列相似度为100%,THN1、T9541、T15113、4A1和C.proteolyticum 9670T的PG酶蛋白序列相似度为74%以上,可见不同种菌株产生的PG酶序列存在差异,来源于不同菌种的PG酶性质可能不同,对植物蛋白的脱酰胺程度不一样,进而拓展PG酶在食品工业领域的应用。通过分析菌株的产酶曲线,确定其快速产酶期、酶活最高点,便于更好地指导菌株在实践中的应用。4.原生质体-UV诱变育种优化制备原生质体的条件,确定最佳条件为:菌浓度为OD600=5,25mg/m L溶菌酶,30℃酶解1.5h,加入100μL 0.1%SDS,此时,原生质体的形成率、纯度、再生率这三者乘积为75.94%,相比较实验室前期建立的原生质体制备方法,效率提高了45.76%。根据致死率、正突变率,确定UV照射时间为30s。优化酶促反应的底物浓度,酶活增加到3.04U/m L,提高了32.17%。经过三轮诱变筛选,共计初筛6351菌株,得到菌株PU0316,酶活为3.73U/m L,提高15.48%。本研究筛选到可以正常分泌PG酶的白色解朊金黄杆菌,便于后期PG酶的发酵纯化,丰富了菌株类型。5.菌株发酵条件的优化通过单因素优化,确定乳糖为最佳碳源,多聚蛋白胨为最佳氮源,促进剂可以稳定培养基的p H、铵离子保持较低水平,司盘80对菌株生长有促进作用,通过优化发酵条件,确定菌株最优产酶的培养条件是:0.1%乳糖、2.0%多聚蛋白胨、1.5%促进剂、240r/min转速,此时,菌株的产酶最高,酶活为5.31 U/m L,提高55.72%,是目前文献报道的最高PG酶酶活。本研究根据文献报道的产PG酶菌株的生长特性,采用F富集培养基,10%的土壤悬液接种量,培养5天进行富集,与现有文献报道的培养9天相比较,本研究的筛选方法富集时间缩短,筛选效率提高,菌株阳性率高,酶活高,从土壤中筛选到酶活为2.15U/m L的高产菌株,酶活比文献报道的最高酶活野生菌株ZYF 120413-7提高了199%。其中,C.oranimense THN1、C.sediminis T9541、C.cucumeris 4A1为本文首次报道的新型产PG酶菌株。测定并分析菌株的PG酶序列,表明不同种菌株产生的PG酶序列存在差异,PG酶的性质可能不同,对植物蛋白的脱酰胺程度不一样,最适作用条件不一样,进而拓展PG酶在食品工业领域的应用。应用原生质体-UV诱变筛选到色素缺失的白色高产PG酶菌株,可以为后续纯化提供方便。通过优化发酵条件,酶活提高至5.31 U/m L,是目前文献报道的最高PG酶活性,本研究通过筛选获得了高产PG酶的菌株,为PG酶的大规模工业化生产奠定了基础。