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本研究在大鼠出生后发育的关键窗口期(第2天)肌肉注射GLP-1质粒,在大鼠达到青年期性成熟时(54天)采用高架十字迷宫法检测了青年大鼠的焦虑样行为,8周龄(56天)时屠宰采集血浆、肾上腺、海马,肾上腺称重、并计算肾上腺指数.采用酶免法(EIA)测定血浆皮质酮含量,用实时定量RT-PCR(real time RT-PCR)方法检测海马GR、DNMT1、GLP-1R、NGFI-A基因mRNA表达,用Western blot方法检测海马GR和DNMT1蛋白表达,最后用亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测GR启动子exon17的甲基化水平,以揭示GLP-1调控海马GR表达、进而程序化影响青年大鼠行为的分子机制。
1.青年大鼠焦虑样行为检测
高架十字迷宫(elevated plus maze,EPM)结果表明注射GLP-1质粒(GLP-1Plasmid, GP)的大鼠进入开臂的次数(OE%,P=.024)和在开臂待的时间(OT%,P=.021)都显著高于注射空白质粒(Vacant Plasmid,VP)的大鼠,表现明显的抗焦虑样行为;然而,GP组大鼠进入开臂和闭臂的总次数(OE+CE,P=.011)显著低于VP组大鼠,表明其运动活力显著下降。
2.肾上腺指数和血浆皮质酮检测
两组大鼠肾上腺指数未表现有显著差异(P=.172)。酶免法(enzymeimmunoassay,EIA)测定皮质酮结果表明,GP组大鼠血浆皮质酮水平有所提高,但差异也不显著(P=.42)。
3.海马GR mRNA和蛋白表达
鉴于海马GR在动物焦虑样行为中起着重要的调节作用,本实验检测了海马GRmRNA和蛋白水平。GP组大鼠海马GR mRNA表达显著高于VP组大鼠(P=.01),GR蛋白表现升高的趋势(P=.119)。
4.海马DNMT1 mRNA和蛋白表达
为分析GP组海马GR表达上调是否与DNA甲基化有关,本实验检测了大鼠海马DNMT1表达,发现GP组海马DNMT1 mRNA(P=.024)和蛋白水平(P=.009)均显著低于VP组大鼠。提示DNA甲基化可能参与GR转录调控。
5.海马GR启动子DNA甲基化水平检测
提取GP组和VP组大鼠海马基因组DNA后,采用亚硫酸氢盐测序法检测GR exon17启动子区域甲基化水平,克隆测序结果表明在转录因子NGFI-A结合的两个CpG位点均没有甲基化,其他15个CpG位点也只有零星的甲基化.提示GR exon17启动子区域DNA甲基化可能不参与GLP-1导致的GR转录上调。
6.海马GLP-1R和NGFI-A mRNA表达
GP组大鼠GLP-1R(P=.009)和NGFI-A(P=.001)表达均显著高于VP组,表明肌肉注射GLP-1可能通过作用于其海马受体提高NGFI-A表达,进而调控GR表达。
综上,新生期肌肉注射GLP-1质粒可能通过其海马受体介导,诱导GR转录因子NGFI-A表达上调,从而程序化调控海马GR的转录,进而影响青年大鼠行为。