番鸭GnRHR基因全长cDNA克隆、时空表达及对产蛋性能的关联研究

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为了研究番鸭就巢机理,选择与繁殖性能密切相关的促性腺激素释放激素受体(GnRHR)基因作为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术克隆GnRHR基因的全长cDNA序列;使用多种生物信息学软件对该基因核酸序列及对应编码的蛋白序列进行分析,为开展对该基因功能的分子机制的研究提供理论基础;根据番鸭GnRH基因序列和克隆的GnRHR基因cDNA序列,在它们的保守区设计特异性引物,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)为内参基因,通过建立Real-time PCR检测方法,统计分析两种基因在番鸭不同组织、不同时期的表达差异性,研究就巢期的表达规律;采用覆盖法,在得到的全长cDNA基础上获得GnRHR基因的DNA序列,利用PCR-SSCP和PCR-RFLP两种方法检测GnRHR基因的多态性,并分析与番鸭产蛋性能之间的关联性。试验结果如下:1.在番鸭垂体中成功克隆GnRHR基因,该基因全长cDNA为1680bp,其中,氨基酸编码区长为1248bp,可编码415个氨基酸。通过不同物种序列比对和同源性分析,该基因与原鸡和火鸡的核酸序列同源性,分别为90%和88%;与原鸡的氨基酸序列同源性为88%,系统进化树分析显示,番鸭垂体GnRHR基因属于Ⅱ型。蛋白结构分析结果表明GnRHR含有1个G-protein coupled receptorsfamily1结构域,具有7次跨膜结构,属于G蛋白偶联受体家族。二级结构预测发现蛋白有48.43%的α螺旋、6.02%的β折叠、45.54%的无规则卷曲结构,同源建模得到三维结构。2. GnRHR基因在番鸭下丘脑、垂体和性腺组织中表达量较高,该三种组织的表达量显著高于肌胃、胰脏、心脏、十二指肠、脾脏、肝脏和腺胃的表达(P<0.05)。在番鸭HPG轴上研究GnRHR和GnRH两个基因不同时期的表达差异,结果表明对于母番垂体鸭GnRHR基因在产蛋期(36周)表达量最高,显著高于其他时期(P<0.05),下丘脑和卵巢的表达与垂体相似;垂体的GnRH基因在性成熟期(23周)和产蛋期(36周)表达较高,且两者差异不显著(P>0.05),在下丘脑和卵巢的表达也与垂体相似。但对于公鸭垂体GnRHR基因在性成熟期(23周)表达量最高,且显著高于其他时期(P<0.05),下丘脑和睾丸的表达与垂体相似;GnRH基因的表达与母番鸭的相似。3.测序得到番鸭GnRHR基因的DNA序列有三个内含子,在内含子2的片段GR1上检测到一个位点的碱基突变,为CT突变;检测分析发现存在AA、AB和BB三种基因型,不同基因型与开产日龄、最长连产天数、平均连产天数和300日龄产蛋数显著相关(P<0.05)。
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