蛋白酶作为最重要的工业酶制剂之一,销售额占所有工业酶制剂销售量的60%以上,随着蛋白酶相关研究的增多,对于蛋白酶活力测定方法简便性、快捷性和全面性方面的要求也日益增高。目前蛋白酶活力的测定方法包括福林酚法、偶氮酪蛋白法和AAPF法等,但这些蛋白酶活力测定方法存在操作复杂或仅能体现部分蛋白酶活力等缺点,亟待开发一种简便快捷且全面的蛋白酶活力测定方法。本研究以AAPF法为基础,将Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p NA（AAPF）中的Phe替换为其余19种常见氨基酸,合成了20种短肽底物AAPX,建立了以AAPX为底物的混合多肽法（AAPX法）用于蛋白酶活力测定,并优化了AAPX法的反应条件。弹性蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K以不同AAPX单体和AAPX混合溶液为底物时的酶活力测定结果表明,以AAPX混合溶液和AAPF单体溶液为底物时的比活力分别为5.39、14.96、2.96、38.66 U/mg和1.82、9.38、0.33、15.01 U/mg,且测定误差可控制在10%以内;此外,糜蛋白酶可以有效水解AAPY、AAPF和AAPW,胰蛋白酶可以有效水解AAPK和AAPR。证明相对于AAPF法,AAPX法可以更全面的测定出蛋白酶的酶活力,并可用于蛋白酶的底物特异性分析。为获得高酶活蛋白酶突变体,将AAPX法应用于了克劳氏芽胞杆菌来源蛋白酶（CPR）突变库的筛选,得到了酶活力分别为野生型CPR 156.34%、159.20%和195.07%的S101H、S101R和S101W突变体。随后利用AAPX法对突变体的酶学性质进行了测定,S101H、S101R和S101W的最适温度和最适p H与野生型CPR相同,均为60°C和p H 10.0,热稳定性和p H稳定性相对于野生型CPR出现了不同程度的下降。为获得高底物特异性蛋白酶,将AAPX法应用于了解淀粉芽胞杆菌来源蛋白酶的筛选。从解淀粉芽胞杆菌基因组上筛选得到了24种蛋白酶基因,成功在枯草芽胞杆菌中对其中21种蛋白酶基因进行了表达,利用AAPX法对其进行筛选后,获得了酶活力为6.45 U/m L的胞内丝氨酸蛋白酶ISP,其能够有效水解AAPY、AAPF、AAPH、AAPK、AAPM、AAPL和AAPW。将ISP在大肠杆菌中表达及纯化后,以AAPX混合溶液为底物测定了ISP的酶学性质,结果表明,其最适p H为8.0,最适温度为30°C;并在30°C以下时具有一定的稳定性,在p H 9.0-11.0条件下稳定性较好。