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1目的1.1观察体外培养小鼠神经干细胞(NSCs)分化为神经元样细胞的电生理特征。1.2 NSCs植入缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)小鼠脑内,分析其分化为神经元样细胞的电生理特征,探讨NSCs治疗HIE小鼠可能机制,并行安全性评估。1.3应用亚低温联合NSCs移植治疗小鼠缺氧缺血性脑病(HIE),观察其疗效,探索亚低温改善NSCs治疗HIE小鼠的可能机制。2方法2.1体外分离并培养胚胎来源NSCs,探索其分化潜能,并进行电生理功能鉴定。2.2将小鼠随机分为三组:SHAM组(假手术组);HIE+PBS组(安慰治疗组);HIE+NSCs组(治疗组)。分别进行移植细胞的追踪鉴定,行为学的评价及安全性评估2.3将小鼠随机分为五组:对照组(control组);HIE+hypothermia组(亚低温治疗组);HIE组;HIE+NSCs+hypothermia组(亚低温联合NSCs治疗组);HIE+NSCs组(常温治疗组)。分析比较不同组间差异。3结果3.1 C57/BL6胎鼠来源的NSCs呈单一细胞贴壁生长,并表达Nestin,Sox-2多能干性标记物。贴壁培养的细胞在分化培养基培养后,原有的单一形态发生变化。分化的神经细胞分别表达Neu N,GFAP,CNPase神经元,星形胶质细胞与少突胶质细胞标记物。其中,神经元样细胞的静息膜电位及全细胞电容值与未分化的状态相比较有明显差异(p<0.5)。同时可记录到能被Na+通道阻断剂TTX阻断的快速激活、快速失活的Na+内向电流和瞬时外向的快失活钾电流。3.2 HIE+PBS组(安慰治疗组)与HIE+NSC组(治疗组)比较,梗死容积差异均有统计学意义(P<O.05)。但HIE+NSC组(治疗组)第1与4周相比较,差异没有统计学意义。接受移植的新生鼠脑组织可见GFP标记阳性同时表达Neu N,GFAP,CNPase标记双阳性细胞,分别约占植入细胞比例的11~14%,63~77%和2~6%左右。4wek时GFP标记阳性细胞较1week时减少60%左右。其中,神经元样细胞的静息膜电位,膜输入阻抗及全细胞电容值与体外培养的神经元样细胞相比较没有明显差异。同时可记录到Na+动作电位和自发兴奋性突触后电流。Rotarod Test:NSC治疗组小鼠至第21天时与PBS治疗组相比差别具有显著性差异(P<0.05);Cylinder Test:NSC治疗组随着时间恢复,21天后和PBS治疗组的缺血侧肢体的使用频率也有显著差异(P<0.05);Morris水迷宫:而第2月和第6月相比较,NSC组小鼠的逃避潜伏期较PBS组缩短(P<0.05)。3.3亚低温能给移植细胞提供神经保护,NSCs+hypothermia组的TUNEL染色阳性细胞数与HIE组,NSCs组相比较出现下降,但与Hypothermia组相似。NF-κB蛋白及pro-caspase3裂解活性形式蛋白的表达水平在Hypothermia组和NSCs+hypothermia组都是显著低于HIE组和NSCs组的。细胞移植后NSCs+hypothermia组的梗死体积都是显著低于NSCs组的(p<0.05),低于hypothermia组(p<0.05)。Rotarod test:NSCs+hypothermia组在所有检测的时间点上的行为学改善都是显著优于NSCs组与Hypothermia组的(p<0.05)。Cylinder test:NSCs组,Hypothermia组和NSCs+hypothermia组行为学在细胞移植后即有改善,但组间的行为学改善没有显著差异。Morris水迷宫:NSCs+hypothermi组小鼠较Hypothermia组及NSCs组行为学改善有显著提高(p<0.05)。NSCs+hypothermia组移植细胞的存活率显著优于NSCs组(p<0.05)。NSCs+hypothermia组的NSCs在细胞移植后更易于分化为Neu N阳性的神经元样细胞(p<0.05)。4结论体外培养的NSCs分化为的神经元样细胞具有成熟神经元电生理特性。体内实验表明:NSCs植入HIE小鼠脑内,能向缺血损伤区迁移,能分化为神经细胞样细胞,并改善小鼠运动和认知功能,但存在移植细胞向神经元分化比例低,移植存活率下降等缺陷。亚低温结合神经干细胞移植组能弥补单纯神经干细胞移植组的缺陷,给移植细胞提供神经保护,其机制可能是与抑制炎症和凋亡相关。