褐飞虱同源异型盒基因家族鉴定与功能分析

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同源异型盒(Homeobox)基因在后生动物中广泛存在,且高度保守。Homeobox基因编码一段约60个氨基酸组成的homeodomain(HD)结构域,具有与DNA特异性结合,参与转录调控的功能。褐飞虱(Brown planthopper,Nilaparvata lugens),隶属于半翅目飞虱科,为不完全变态昆虫,是我国以及东南亚各国水稻种植区的头号害虫。目前,对褐飞虱homeobox基因的研究还缺乏系统的分析。本文通过基因组、转录组、基因沉默等实验技术对褐飞虱homeobox基因进行了系统的鉴定及功能探究,研究结果如下:1.明确了褐飞虱homeobox基因的数量、分类以及序列特征。本文鉴定得到了隶属75个基因家族的94个褐飞虱homeobox基因。根据这94个homeobox基因的氨基酸、保守域、HD序列的分析,将其归类成9个class:ANTP(43),PRD(24),LIM(8),POU(4),SINE(3),TALE(7),CUT(2),ZF(2)及CERS(1),其中ANTP class又可再细分为HOXL subclass(18)与NKL subclass(25)。同源比对发现,除了Pknox基因外其余93个褐飞虱homeobox基因都存在着果蝇的同源基因。Pknox基因虽然没有果蝇同源序列,但是意大利蜜蜂、赤拟谷盗存在它的同源基因。此外,褐飞虱中有11个homeobox基因(cad、Dfd、btn、Dll、Dr、al、oc、prd、repo、ap、Lim3)在进化中通过复制产生了旁系同源基因。2.明确了褐飞虱homeobox基因的时空表达模式。本研究利用表达谱数据分析了homeobox基因在胚胎期、若虫期及成虫期共15个时间点的时序表达情况,以及在雌成虫8个不同组织中的组织表达情况。发育表达模式表明,81个基因(88%)在卵期有一个较高的表达水平,在若虫期表达量较低,这些基因可能参与褐飞虱胚胎发育的过程。组织表达模式表明,54个基因(59%)展现出了明显的组织表达特异性,其中10个基因在产卵针中高表达,18个基因在触角中高表达,10个基因在头部中高表达,16个基因在卵巢中高表达。3.鉴定了参与发育、生殖以及胚胎发育相关的褐飞虱homeobox基因。本研究成功合成了89个褐飞虱homeobox基因的RNA双链。对四龄若虫进行的RNA干扰实验发现,若虫期沉默pb、abd-A、vnd、ap_1、otp、Lim3_2、vvl、ct的表达会造成褐飞虱在若虫期死亡,无法获得羽化的成虫,表明这8个homeobox基因是褐飞虱若虫发育必不可少的。RNA干扰实验发现,14个基因的沉默则影响褐飞虱成虫形态与功能,导致四类表型缺陷,其中干扰Dll_1或Dll_2导致足部末端的缺陷;干扰eyg或Scr则导致瘦小的体型;干扰al_2或Awh则会影响雌性产卵器的发育;干扰Ubx、nub、Dr_1、ap_1、mirr、zfh2、exd以及hth这8个基因则在不同程度上影响了褐飞虱成虫翅的发育。通过对五龄褐飞虱的RNA干扰,发现了9个(schlank、Lim3_2、ap_1、Pknox、vis、abd-A、C15、nub、prd_2)影响雌性褐飞虱生殖力的基因。通过对8个(lab、pb、Dfd_1、Scr、Antp、Ubx、abd-A、Abd-B)典型的Hox基因的母体干扰,发现胚胎中缺少lab、pb、Dfd_1、Scr这4个基因的表达会导致若虫头部或头部附肢的畸形;母体干扰Ubx则会造成后代若虫腹部第一体节长出附肢;干扰Abd-B则导致了后代若虫腹部体节的畸形;abd-A基因的沉默会导致胚胎腹部附肢的生长,且使胚胎无法孵化。母体干扰实验表明,褐飞虱Hox基因也在胚胎发育过程中参与体节与附肢的分化,但其与完全变态昆虫中的功能存在一定差异。4.明确了Ubx基因在褐飞虱形态发育中的功能。褐飞虱Ubx在后翅中大量表达,在短翅种群褐飞虱中沉默Ubx的表达导致后翅翅芽的发育,在长翅种群褐飞虱中沉默Ubx的表达则导致后翅向前翅转化。双基因干扰实验结果表明,Ubx基因可能是通过胰岛素信号通路介导短翅褐飞虱后翅的发育。此外,Ubx基因的缺失也影响了后足的形态和功能。通过母体干扰Ubx基因,发现后代若虫腹部第一体节长出类似足的附肢,表明Ubx调控了第一腹节向第三胸节的转变。本论文首次对半翅目昆虫的Homeobox进行了系统的梳理,研究结果为理解昆虫Homeobox进化及形态多样性提供了有价值的理论基础。
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