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目的:通过体外实验探究高纯度乳酸链球菌素Nisin Z(Nisin ZP)单独及其与次氯酸钠(Na Cl O)联合对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的体外抗菌和抗生物膜效应,为Nisin Z在根管治疗中的应用提供理论依据。方法:1、用微量稀释法测定Nisin Z、Na Cl O分别对悬浮态粪肠球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。2、用微量棋盘法测定Nisin Z与Na Cl O联合应用对粪肠球菌的体外抗菌活性,以分级抑制浓度指数(FICI)判定两药的联合效应。3、通过Time-Kill研究测定Nisin Z和Na Cl O单用或联合的动力学抗菌性。4、在96孔板中制备粪肠球菌的24h生物膜后随机分组。不同浓度的Nisin Z分为5组,分别为B1(256×MIC)、B2(64×MIC)、B3(16×MIC)、B4(4×MIC)、B5(1×MIC);同时设B6(无菌三蒸水)为阴性对照(生长对照),B7(2.5%Na Cl O)为阳性对照。采用MTT法检测各组药物作用24h后粪肠球菌生物膜的OD值,比较各组之间差异。Nisin Z与Na Cl O等体积混合后分为3组,分别为C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)、C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O);同时设C4(无菌三蒸水)为阴性对照(生长对照),C5(2.5%Na Cl O)为阳性对照。用MTT法检测各组药物作用24h后粪肠球菌生物膜的OD值,比较各组之间的差异。5、在盖玻片上制备粪肠球菌的24h生物膜后随机分组。不同浓度药物分为8组,分别为D1(1×MIC)、D2(4×MIC)、D3(16×MIC)、D4(64×MIC)、D5(256×MIC)、D6(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)、D7(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、D8(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O);同时设D9(2.5%Na Cl O)为阳性对照,D10(无菌三蒸水)为阴性对照。生物膜分别经各组药物作用24h后,进行SYTO-9/PI荧光染色,然后将玻片置于激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)下,观察粪肠球菌生物膜结构中的细菌染色情况和形态破坏程度。结果:1、Nisin Z和Na Cl O单独应用时对悬浮态粪肠球菌的MIC、MBC分别是6μg/m L、15μg/m L和0.0625%、0.25%。2、Nisin Z与Na Cl O联合时的最低抑菌浓度分别为0.023μg/m L(1/256×MIC)和0.03125%(1/2×MIC),FICI值为0.504,为相加作用。3、24h时间-杀菌曲线显示,Nisin Z和Na Cl O对粪肠球菌的抗菌作用呈浓度依赖性;两药单独应用时,从2×MIC开始对粪肠球菌有明显抑制作用,4×MIC时显示出杀菌效应,联用时能以更低浓度在更短时间内显示出杀菌作用。4、经药物作用24h后粪肠球菌生物膜的OD值,B1(256×MIC)、B2(64×MIC)、B3(16×MIC)、B4(4×MIC)、B5(1×MIC)分别与B6(阴性对照)比较,差异有统计学意义(P<0.05);B1(256×MIC)、B2(64×MIC)、B3(16×MIC)、B4(4×MIC)、B5(1×MIC)分别与B7(阳性对照)比较,差异有统计学意义(P<0.05);B1(256×MIC)、B2(64×MIC)、B3(16×MIC)、B4(4×MIC)、B5(1×MIC)之间两两比较,除B2(64×MIC)与B3(16×MIC)之间差异无统计学意义(P>0.05),其余任意两组之间比较均有差异(P<0.05)。不同浓度药物联合对粪肠球菌生物膜作用24h后的OD值,C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)、C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)分别与C4(阴性对照)比较,差异有统计学意义(P<0.05);C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)、C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)分别与C5(阳性对照)比较,差异有统计学意义(P<0.05);C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)、C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)之间两两比较,C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)与C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)之间差异无统计学意义(P>0.05),C1(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)与C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)、C2(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)与C3(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)之间比较均有差异(P<0.05)。5、激光共聚焦显微镜观察结果显示,不同浓度Nisin Z组D1(1×MIC)、D2(4×MIC)、D3(16×MIC)、D4(64×MIC)、D5(256×MIC)于CLSM下可见,随着浓度增加,绿色荧光面积降低,红色区域明显增加,结构逐渐稀疏;联合用药组D6(1×MIC Nisin Z+0.25%Na Cl O)、D7(1×MIC Nisin Z+0.5%Na Cl O)、D8(1×MIC Nisin Z+1%Na Cl O)于CLSM下可见绝大多数菌体呈红色荧光,叠加后出现多数红色或橘黄色区域;随着Na Cl O浓度增加,总体细菌数量减少,生物膜结构变得稀疏,呈散在零星分布;D9(阳性对照)可见生物膜稀疏,总体荧光减少,主要是散在红色荧光;D10(阴性对照)可见生物膜细菌密集、层叠,镜下大部分细菌呈绿色,红色死菌仅少量散在,叠加后以绿色荧光为主。结论:1、Nisin Z对悬浮态粪肠球菌具有较好的抗菌作用。2、Nisin Z和Na Cl O对粪肠球菌的抗菌作用呈浓度依赖性,在体外Nisin Z与Na Cl O联合具有相加作用,二者联合使用可降低药物使用浓度,缩短药物作用时间。3、Nisin Z对粪肠球菌生物膜有一定抑制作用,与Na Cl O联合应用时具有较强的抗生物膜作用。