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研究背景:骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种系统性炎症性代谢骨病,其特征是骨量与骨密度降低以及骨组织微观结构恶化,且由此引发了骨骼脆性增加和骨折易感性增强的并发症[1]。在原发性骨质疏松症中,绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis,PMOP）是最常见的一种类型,在老年女性人群中发病率居高不下,一般在女性绝经后的5到10年内发生,因其易导致锥体及髋部等部位骨折,在降低个体生活质量的同时也给社会带来了巨大的经济与人力资源负担[2-3]。骨重塑处于高水平状态且骨质吸收与骨质生成之间平衡紊乱被认为是PMOP的主要发病机制[4]。性类固醇激素对骨骼系统的稳态维持起到了关键的作用,对绝经后妇女进行雌激素替代治疗后其椎体及髋部骨折率大大降低[5]。雌激素对骨质丢失的抑制作用主要体现在以下两个方面:首先,雌激素可以直接导致骨质中破骨细胞数量减少,影响破骨细胞的形态及大小且使其活性降低[6];其次,雌激素可提高成骨细胞中凋亡相关因子配体（Fas L）的表达,通过增强成骨细胞与破骨细胞之间的相互作用进而诱导破骨细胞的凋亡[7]。绝经后机体循环中雌激素含量减少,破骨细胞生成增加、成熟破骨细胞凋亡减少以及发生时间推迟[8]。成熟破骨细胞凋亡减少及推迟致使破骨细胞生命周期延长,骨吸收功能发挥时间延长,同时阻碍了成骨细胞的生成及募集,骨质生成作用发挥受限,骨质吸收与骨质生成之间平衡打破,致使绝经后骨质大量丢失、骨密度下降引发骨质疏松症[8]。越来越多的证据表明,破骨细胞生命周期延长在骨重塑失衡中扮演者重要的角色[9]。因此,我们认为通过促进成熟破骨细胞凋亡缩短其寿命来减少破骨细胞介导的骨质过度吸收是PMOP防治的另一个具有前景的策略。临床工作中骨质疏性骨折的临床治疗规范是先进行骨质疏松的治疗处理后行手术治疗,且术后继续进行骨折疏松治疗[1]。骨质疏松的治疗中,饮食与药物同等重要,我们对饮食食材进行了筛选及药理学分析、检索文献查阅古籍,发现莲子心不论是以茶泡饮还是日常食用都受到人们的喜爱,且莲子心具有清心安神、抗氧化、抗炎止血等作用,其活性成分包括生物碱类、黄酮类及水溶性多糖等。莲心碱是莲子心生物活性成分中研究最为丰富的一种双苄基四氢异喹啉生物碱[10]。研究表明莲心碱其具有促肿瘤细胞凋亡、抗炎、抗氧化等多种药理作用[11]。可用于肿瘤的治疗中,抑制胸腺肿瘤的侵袭作用,促进肿瘤细胞的凋亡发生,抑制胸腺肿瘤对骨质的侵袭[12]。鉴于莲心碱抗炎、促肿瘤细胞凋亡等药理作用,我们认为莲心碱或许具有缓解骨质丢失的作用,有望成为治疗骨质疏松症的一种安全有效的选择。本研究旨在观察莲心碱对去卵巢小鼠骨质的影响,并探讨其可能的分子机制。研究目的:1、利用体内实验,观察莲心碱对去卵巢小鼠骨组织的影响;2、利用体外实验,观察莲心碱对破骨细胞分化、功能、生存的影响;3、利用体外实验,研究莲心碱对骨质及破骨细胞作用的分子机制。研究方法:第一部分:莲心碱对去卵巢小鼠骨质丢失及血清破骨、成骨及炎症指标的影响作用实验对象为成年雌性小鼠（C57BL/6,6-8周龄）,将其随机分为三组:（1）假手术组（Sham组）;（2）去卵巢骨质疏松模型组（空白对照组OVX）;（3）去卵巢骨质疏松模型+莲心碱实验治疗组（实验组OVX+Lie）,每组6只（n=6）。其中,假手术组仅对实验小鼠行背部皮肤切开缝合术,不做卵巢摘除处理;另外2组实验小鼠均行卵巢切除术（OVX）。术后48小时开始,骨质疏松模型空白对照组（OVX）每天腹膜下注射0.2ml 0.9%生理盐水,实验治疗组每天于腹膜下注射0.2ml莲心碱（Liensinine）（0.9%生理盐水进行配置）,莲心碱注射剂量为30mg/kg,实验时间为6周。6周后取小鼠双侧股骨,一侧股骨进行脱钙、包埋处理,做石蜡切片,进行H&E、Trap染色;另一侧股骨经多聚甲醛固定3天后PBS冲洗,做Micro CT骨参数扫描检查。通过小鼠眼静脉取血后,静置离心得血清样本,进行ELISA实验检测,检测体内破骨、成骨以及无菌性炎症相关标志物的表达水平。第二部分:体外条件下,莲心碱对破骨细胞分化、功能及存活的影响作用通过CCK8检测不同药物浓度对单核巨噬细胞系RAW264.7和原代小鼠骨髓单核细胞（Bone marrow mononuclear cells,BMMCs）增殖活性的影响。以RANKL+M-CSF与RANKL作为体外诱导条件,分别诱导小鼠骨髓中提取的骨髓单核细胞（BMMCs）与单核巨噬细胞系RAW264.7向破骨细胞分化。实验分五组:（1）空白对照组,即未诱导分化组;（2）诱导分化组;（3）诱导分化+低浓度莲心碱组（1μM）;（4）诱导分化+中等浓度莲心碱组（2μM）;（5）诱导分化+高浓度莲心碱组（4μM）。利用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）染色检测分化成熟的破骨细胞数量及形态;利用破骨细胞肌动蛋白环染色（F-actin ring）测定不同浓度下莲心碱对破骨细胞肌动蛋白环形成的影响。将同等数量的分化成熟破骨细胞接种到羟基磷灰石仿生骨板后利用不同浓度的莲心碱干预处理,观察骨陷窝数量及面积差异,推断成熟破骨细胞骨吸收功能发挥是否被抑制。第三部分:体外实验探究莲心碱对去卵巢小鼠骨质及破骨细胞影响的机制首先,对第一部分实验中骨组织切片进行TUNEL染色观察骨组织中破骨细胞凋亡情况。其次,以RANKL+M-CSF作为体外诱导条件,诱导小鼠骨髓中提取的骨髓单核细胞（BMMC）向破骨细胞分化。根据是否含有诱导因子与莲心碱,将实验分为8组:（1）OC（破骨细胞）+RANKL、（2）OC+RANKL+1μM Lie、（3）OC+RANKL+2μM Lie、（4）OC+RANKL+4μM Lie、（5）OC、（6）OC+1μM Lie、（7）OC+2μM Lie、（8）OC+4μM Lie,处理后进行Hoechst33258染色并于3h,6h,24h及3、7天观察破骨细胞凋亡情况和破骨细胞凋亡百分比。最后,以RANKL+M-CSF作为诱导条件体外诱导原代小鼠BMMCs分化为成熟破骨细胞。实验分为三组:（1）空白对照组,即未诱导分化组;（2）诱导分化组;（3）诱导分化+莲心碱组（4μM）。通过免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）染色检测Fas、Fas L蛋白的表达;应用Western blot技术检测凋亡相关通路蛋白Fas、Fas L、caspase-8、caspase-9、caspase-3、细胞色素C、Bcl-2、Bax的表达。结果:体内实验结果:相较于假手术组,去卵巢雌性小鼠饲养6周后骨质丢失明显,股骨H&E染色图像显示骨小梁数目明显减少,Micro CT骨扫描检测结果显示骨小梁数目（Tb.N）明显减少,骨密度（BMD）、骨表面积和骨体积比（BS/TV）、骨体积分数（BV/TV）下降明显;骨组织切片TRAP染色结果显示股骨干骺端骨小梁表面破骨细胞比例增多,形态较大,且核数量较多。静脉血ELISA检测结果显示,炎性细胞因子TNF-α、IL-6含量增多,破骨细胞标志物CTX-1、TRAc P-5b含量升高,成骨相关标志物Osteocalcin含量水平无明显差异。经腹膜下注射予以莲心碱干预后,去卵巢小鼠骨密度（BMD）明显增加。去卵巢小鼠骨质丢失情况改善:骨小梁数目（Tb.N）、骨体积分数（BV/TV）、骨表面积和骨体积比（BS/TV）比OVX组明显增加。骨组织切片TRAP染色骨小梁表面破骨细胞数量减少,且呈现出脱离骨表面以及固缩等形态改变,血清学ELISA检测结果显示炎性细胞因子TNF-α、IL-6以及破骨相关标志物TRAc P-5b与CTX-1水平比OVX组减低,成骨相关标记物无影响。体外实验结果:首先,莲心碱明显减少破骨细胞存活数量,且效果程剂量依赖性,表现为TRAP染色细胞阳性细胞数目比诱导分化组明显减少。其次,莲心碱作用下破骨细胞骨吸收功能受到明显抑制。莲心碱干预作用下可检测到的成熟破骨细胞肌动蛋白环形数量及面积比诱导分化组明显减少;莲心碱干预作用下破骨细胞对羟基磷灰石骨板的吸收能力比诱导分化组破骨细胞下降,骨陷窝面积与诱导分化相比明显减少。机制研究实验结果:首先,骨组织切片TUNEL染色结果提示,TRAP染色中莲心碱处理组小鼠骨组织样本观察到的形态改变破骨细胞发生了凋亡。其次,莲心碱促进实验小鼠骨髓单核细胞（BMMCs）诱导（RANKL+M-CSF）成熟的破骨细胞凋亡发生,缩短其生命周期,表现为在TRAP染色阳性细胞数目减少基础上Hoechst 33258染色免疫荧光检测显示莲心碱作用下破骨细胞凋亡发生起始时间提前,以及破骨细胞生命周期缩短,破骨细胞寿命缩短。最后,通过免疫荧光实验检测到,相比诱导组,莲心碱处理组破骨细胞Fas、Fas L表达增加。此外,Western Blot实验,莲心碱干预处理后,破骨细胞caspase-8、caspase-3、caspase-9、细胞色素C表达增加;Bax表达增加,Bcl-2表达降低,Bax/Bcl-2比值升高。表明莲心碱的干预增强了成熟破骨细胞Fas/Fas L诱导的内源性线粒体途径凋亡通路,进而促进了成熟破骨细胞的凋亡。结论:1、体内实验结果表明,莲心碱干预可以改善小鼠去卵巢后的骨质丢失情况;减少骨表面破骨细胞数量;降低去卵巢小鼠体内炎性细胞因子及破骨细胞标志物的体内含量。2、体外实验结果证实,莲心碱减少破骨细胞存活数量,抑制破骨细胞骨吸收功能发挥;促进RANKL诱导条件下成熟破骨细胞的凋亡且抑制破骨细胞激动蛋白环形成以及破骨细胞的骨吸收功能;3、机制实验结果揭示,莲心碱通过增加破骨细胞Fas、Fas L的表达增强破骨细胞对Fas/Fas L介导的内源性线粒体凋亡途径的敏感性,从此促使破骨细胞凋亡提前发生,生命周期缩短,进而导致破骨细胞骨吸收功能发挥受到抑制;使得去卵巢小鼠体内骨质丢失情况得到缓解。