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猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一种急性、接触性传染病,TGEV可引起仔猪肠黏膜上皮细胞(intestinal epithelial cell,IPEC)发生变性、死亡,造成肠管水、电解质代谢紊乱,营养吸收障碍,从而引起仔猪腹泻、脱水、营养流失,甚至死亡。非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)包括微小RNA(microRNA,miRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等,在细胞新陈代谢、线粒体损伤以及病毒感染等生理和病理过程中发挥重要调控作用。线粒体是维持细胞正常代谢以及营养吸收功能的关键细胞器之一,前期研究发现,TGEV感染可诱导猪肾细胞PK-15(porcine kidney cell PK-15,PK-15)线粒体肿胀、破裂、功能异常。然而,TGEV是否同样可以诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤,以及在此过程中miRNA和circRNA表达谱的变化情况及调控机制至今尚未见报道。本论文首先建立TGEV感染猪空肠黏膜上皮细胞(intestinal porcine epithelial cell-jejunum 2,IPEC-J2)诱导细胞线粒体损伤模型,然后采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)技术检测TGEV感染后IPEC-J2细胞miRNA和circRNA表达谱的变化,预测、筛选与线粒体相关的miRNA和circRNA。最后利用实时定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、免疫印迹(western blot,WB)、双荧光素酶报告基因(dual luciferase reporter,DLR)分析、流式细胞术(flow cytometry,FCM)等方法研究miRNA和circRNA在TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中的调控作用及机制。研究取得以下结果。1.TGEV感染新生仔猪,48 h后采集仔猪空肠组织,病理组织学检查结果发现,TGEV感染的仔猪空肠壁变薄,肠腔扩张,IPEC细胞变性、死亡,绒毛脱落、变短;电镜检查结果显示,TGEV感染后,IPEC细胞线粒体肿胀、破裂、嵴断裂、数量减少。1.0 MOI TGEV体外感染IPEC-J2细胞24 h,电镜检查发现,IPEC-J2细胞线粒体肿胀、破裂、嵴断裂。使用流式细胞仪、激光共聚焦显微镜及多功能微孔板检测仪检测发现,细胞内线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)异常开放(p<0.01);活性氧(reactive oxygen,ROS)水平升高(p<0.01);线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)降低(p<0.01)。2.利用RNA-seq技术检测TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中miRNA表达谱的变化,筛选得到65个差异表达的miRNAs(fold change≥1.5,FDR≤0.05),其中46个miRNAs表达量上调,19个miRNAs表达量下调。采用RNAhybrid(v2.1.2)+svm_light(v6.01)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version:7.0)3种算法预测差异表达miRNAs的靶基因,得到3088个靶基因。对3088个靶基因进行KEGG富集分析,发现差异表达的miRNAs主要富集于代谢(metabolic pathways)、二次代谢产物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)等通路中;对3088个靶基因进行GO富集分析,发现其中有58个miRNAs对应的286个靶基因定位于线粒体,其中known miRNAs有15个。3.利用RNA-seq技术检测TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中circRNA表达谱的变化,筛选得到123个差异表达的circRNAs,其中69个circRNAs表达量上调,54个circRNAs表达量下调(fold change≥2,FDR≤0.05)。利用Mireap(v0.2)、Miranda(v3.3a)、TargetScan(Version7.0)和StarBase数据库,分析差异表达circRNAs与线粒体相关差异表达miRNAs种子序列结合情况,并通过差异表达circRNAs与miRNAs表达量的负相关性筛选得到与线粒体相关miRNAs存在调控关系的10个circRNAs。qRT-PCR验证circRNAs表达量的变化,结果与RNA-seq一致。4.根据生物信息学分析结果,筛选差异表达较大、与线粒体相关的miR-22作为研究对象,研究其在TGEV诱导线粒体损伤过程中的作用机制。用miR-22 mimics和miRNA inhibitor过表达和沉默miR-22,检测miR-22对mPTP、ROS及MMP的作用,发现miR-22促进TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p<0.01)、ROS积累(p<0.01),降低MMP(p<0.05);预测miR-22靶基因,筛选得到与线粒体相关的15个靶基因,采用双荧光素酶试验和WB试验验证miR-22靶基因,证实HK2是miR-22靶基因。用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默HK2,检测mPTP异常开放情况、细胞内ROS水平以及MMP,结果显示,沉默HK2促进TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p<0.01)、ROS积累(p<0.01)及MMP下降(p<0.05)。5.根据生物信息学预测结果结合双荧光素酶试验验证得到circEZH2与miR-22具有结合能力,FISH试验发现,circEZH2和miR-22可共同定位在细胞质中。构建pcircRNA-circEZH2质粒,并设计合成circEZH2的siRNA,分别转染IPEC-J2细胞,并感染TGEV,检测circEZH2对mPTP的作用,发现circEZH2抑制TGEV诱导的IPEC-J2细胞mPTP异常开放(p<0.01),ROS积累(p<0.05)和MMP下降(p<0.05)。为了证明circEZH2是通过吸附miR-22调控TGEV诱导的线粒体损伤过程,将pcircRNA-circEZH2和miR-22 mimics con(或pcircRNA-circEZH2和miRNA mimics con)转染到IPEC-J2细胞,然后感染TGEV,检测细胞mPTP异常开放情况,结果证实,miR-22能够阻断pcircRNA-circEZH2对TGEV诱导IPEC-J2细胞mPTP异常开放、ROS积累、MMP下降的抑制作用(p<0.05)。本研究首先证实了TGEV诱导IPEC-J2细胞mPTP异常开放、ROS水平升高、MMP降低,造成线粒体肿胀、破裂、嵴断裂,成功构建了TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤模型。进而通过RNA-seq技术检测到TGEV诱导IPEC-J2细胞线粒体损伤过程中有65个miRNAs和123个circRNAs差异表达,并通过靶基因预测和生物信息学分析筛选得到了线粒体相关known miRNAs有15个,通过比对circRNA上的miRNA应答元件(microRNA response elements,MREs)结合circRNA的组成情况预测得到10个circRNAs与线粒体相关known miRNAs具有结合能力。根据生物信息学分析结果,筛选差异表达较大、与线粒体相关的miR-22作为研究对象,并通过双荧光素酶及FISH试验证实circEZH2与miR-22结合。最后,采用一系列实验室手段阐明了circEZH2通过吸附miR-22促进HK2翻译过程,抑制TGEV诱导的线粒体损伤的作用机制。研究结果为进一步揭示TGEV致病机制提供理论依据。