研究一:目的:系统评价益肺散结解毒汤治疗肺癌的有效活性化学成分、药效基因以及主要作用通路方法:通过中药系统药理学数据库搜索益肺散结解毒汤中化学成分以及药物作用靶点,根据“生物利用度OB≥30%和类药性DL≥0.18”条件筛选出益肺散结解毒汤中有效活性化学成分和药物有效靶点,通过靶点基因预测网站人类基因数据库(Genecards)与人类孟德尔遗传数据库(OMIM)预测及筛选治疗肺癌的作用靶点。借助R-3.6.2开发工具寻找益肺散结解毒汤作用靶点与肺癌相关靶点的交集,得出益肺散结解毒汤干预肺癌的药效基因,绘制Venn图,直观反映药效基因。用R-3.6.2工具及bioconductor数据库对药效基因进行中药调控网络构建、GO基因功能和KEGG通路富集分析和网络可视化处理,反应药物-基因-疾病的潜在作用关系,得出益肺散结解毒汤干预肺癌的主要信号通路。结果:1.网络药理学研究结果显示:通过中药系统药理学数据库与分析数据库,根据“OB≥30%和类药性DL≥0.18”条件筛选,共获得活性化学成分95个,其中槲皮素、毛地黄黄酮,谷甾醇(beta-谷甾醇),山奈素,豆甾醇,异鼠李素,黄芩素,黄芩苷、蒽醌类,8-异戊烯基-山奈酚,7-羟基-5,8-二甲氧基-2-苯基-色酮,海因德林,金合欢素,多糖类,香豆素等20中主要活性化学成分表现活跃。获得有效靶点1083个,通过Gencard和OMIM数据库获取肺癌相关基因靶点22184个,药物和疾病共同作用靶点即药效基因215个,其中包括TP53、BCL-2、BIRC5等基因;通过GO基因功能分析,其基因功能富集包括:在核糖核酸聚合酶2转录基因的调节区内,与特定的脱氧核糖核酸序列选择性地和非共价地相互作用,以激活或增加转录(DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase II-specific,25/215),与受体相互作用以影响受体活性变化的基因产物的活性(receptor ligand activity,20/215),以及细胞因子受体结合(cytokine receptor binding,19/215),直接影响细胞因子活性(cytokine activity,17/215);通过KEGG通路富集分析,根据P值图中显示富集程度最高的前20条通路,深入分析可得出益肺散结解毒汤的药效基因主要富集在PI3K-AKT,AGE-RAGE,MAPK信号通路上。结论:经过网络药理学研究方法分析后,我们发现益肺散结解毒汤中含有多种抑制肺癌的有效化学成分,总体来说黄酮类作用的靶点最多,从一定程度上可以反应黄酮类在抗肺癌的过程中发挥着重要作用。筛选出益肺散结解毒汤治疗肺癌的药效基因215个,其中包括TTP53,BCL-2,BIRC5等研究热点基因,通过GO基因功能分析得出益肺散结解毒汤可通过调节细胞因子和受体配体活性,影响细胞因子受体结合以及在核糖核酸聚合酶2转录基因的调节区内与特定DNA作用来达到治疗肺癌的目的。KEGG通路富集分析,益肺散结解毒汤通过多途径、多方面、多靶点对肺癌发挥作用,其中主要通过P I3K-AKT,AGE-RAGE,MAPK信号通路来诱导或促进细胞凋亡,抑制增殖,从而实现抗肿瘤作用。研究二:目的:结合网络药理学的研究结果,初步探究益肺散结解毒汤对人肺腺癌A549细胞的作用及机制方法:用益肺散结解毒汤灌胃SD大鼠,对照组给予等体积生理盐水,共同灌胃5天后腹腔麻醉,腹主动脉取血置于抗凝管中,分别获得含药血浆和空白血浆。选取处于生长分裂期的人肺腺癌A549细胞,分别加入不同浓度的空白血浆,作用24h后,通过CCK8法检测细胞活力,得出空白血浆的细胞抑制浓度,从而确定含药血浆浓度梯度设置范围及梯度。向A549细胞中分别加入不同浓度的益肺散结解毒汤含药血浆,对照组加入相同浓度的空白血浆,常规对照组不加血浆,常规培养。分别作用24h、48h后,在倒置显微镜观察细胞形态改变,用CCK8法检测细胞增殖抑制,RT-PCR法检测人肺腺癌A549中TP53、BCL-2、BIRC5 mRNA的表达量,并与对照组比较,实验数据使用SPSS24软件,采用独立样本t检验对数据比较分析,所得数据用SD(X±S)表示。结果:通过空白血浆增殖抑制实验结果得出在0%-10%浓度范围内,空白血浆组抑制作用与常规对照组比较无统计学差异(P>0.05),为安全范围。为了排除空白血浆对细胞的抑制作用,影响实验结果,所以将含药血浆的浓度梯度设置为2.5%,5%,7.5%,10%;在倒置显微镜下分别观察24h、48h时间点细胞的形态,空白血浆组:肺腺癌细胞呈上皮型,贴壁生长,细胞形状呈类椭圆形且规则、均匀,细胞间紧密连接;含药血浆组:随着培养时间的延长和含药血浆的浓度增加,细胞形态变化明显,轮廓增强、体积缩小,形态不规则,或扁平或延展,细胞间隙变大,部分细胞变圆浮起。通过CC K8检测显示,不同浓度含药血浆在作用于肺腺癌A549细胞24h、48h均对细胞增殖产生抑制作用,经过统计学分析,与相同时间对应浓度的空白血浆组相比有统计学意义(P<0.05),随着含药血浆浓度升高而抑制作用越强,随着作用时间的延长抑制作用也逐渐增强(P<0.05)。RT-PCR结果显示,不同浓度含药血浆组肺腺癌A549细胞中的BCL-2、BIRC5 mRNA的表达量随含药血浆浓度的改变逐渐下降,TP53 mRNA的表达水平逐渐上升。经过统计学分析,与空白血浆组相比,不同浓度含药血浆组中BC L-2、TP53、BIRC5基因表达均有显著差异(P