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背景:食管癌是一种环境相关性肿瘤,严重威胁人类的生命和健康。流行病学与毒理学资料显示,亚硝胺是一类与食管癌相关的潜在环境致癌物,亚硝胺诱发食管癌的致癌机理仍不清楚。炎症微环境是通过促进肿瘤细胞增殖迁移、协助免疫逃逸等方式促进肿瘤发生发展的重要因素。炎症小体是固有免疫的重要组分,其活化可诱导IL-1β、IL-18等炎性介质的成熟和分泌,促进炎症反应的发生,在包括肿瘤在内的多种炎症相关疾病中发挥重要作用。有研究证实NLRP3炎症小体在食管癌组织中高表达,上调NLRP3的表达能够通过促进食管癌细胞的增殖和迁移发挥促癌作用。炎症小体在亚硝胺染毒致食管癌发生发展中的作用机制研究尚未见报道。目的:1.探讨亚硝胺染毒与NLRP3炎症小体活化的关系;2.探讨线粒体活性氧（mt ROS）对亚硝胺染毒食管上皮细胞后NLRP3炎症小体活化的作用;3.探讨亚硝胺诱导食管上皮细胞Het-1A焦亡及其机制。方法:1.亚硝胺致NLRP3炎症小体活化以人源永生化食管上皮Het-1A细胞为靶细胞,分别设立4、20、100、500、2500 ng/m L亚硝胺染毒组,同时设立对照组,染毒时间为48h。通过CCK8、LDH释放实验评价亚硝胺对Het-1A细胞的毒性,采用Western blot检测NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β及IL-1β的表达水平考察NLRP3炎症小体的活化情况。2.mtROS在亚硝胺染毒致Het-1A细胞NLRP3炎症小体活化中的作用采用DCFH-DA和Mito SOX探针对ROS和mt ROS的水平进行检测,采用JC-1探针对线粒体膜电位进行检测。通过添加ROS清除剂NAC、mt ROS靶向清除剂Mito-TEMPO验证mt ROS在NLRP3炎症小体活化中的作用。3.NLRP3炎症小体活化导致caspase-1依赖性细胞焦亡应用PI染色、LDH释放、GSDMD蛋白的表达等观察Het-1A细胞焦亡情况;通过添加caspase-1抑制剂Z-YVAD-FMK及构建NLRP3低表达细胞株分析NLRP3/caspase-1/GSDMD通路在细胞焦亡发生中的作用。结果:1.亚硝胺致NLRP3炎症小体活化1.1亚硝胺对Het-1A细胞的毒性作用（1）20、100、500、2500 ng/m L亚硝胺染毒Het-1A细胞48 h后,与对照组相比,细胞活力分别下降到84.31%,79.01%,75.41%,69.02%;4ng/m L染毒组细胞活力与对照组相比没有明显变化（P>0.05）。（2）染毒48 h后,20、100、500、2500 ng/m L亚硝胺浓度组细胞LDH的释放量逐渐升高,与对照组相比均有统计学差异（P0.05）。这与细胞活性下降结果相一致。1.2亚硝胺致Het-1A细胞NLRP3炎症小体活化炎症小体相关蛋白NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β及IL-1β的表达水平,随着亚硝胺染毒浓度的增加呈上升趋势（P<0.05）,表明亚硝胺诱导了NLRP3炎症小体活化。2.mt ROS介导NLRP3炎症小体活化2.1亚硝胺致Het-1A细胞发生氧化损伤（1）与对照组相比,ROS水平随着亚硝胺染毒浓度的增加而升高（P<0.05）,说明亚硝胺可以诱导Het-1A细胞中ROS的生成。（2）mt ROS水平随着亚硝胺染毒浓度的增加而升高（P<0.05）,说明亚硝胺可以促进Het-1A细胞中mt ROS的生成,并且具有浓度依赖性。（3）与对照组相比,随着亚硝胺染毒浓度的增加,线粒体膜电位呈下降趋势（P<0.05）,说明亚硝胺可以导致Het-1A细胞线粒体损伤。2.2 mt ROS致NLRP3炎症小体活化的机制（1）NAC和亚硝胺共处理组、mito-TEMPO和亚硝胺共处理组与亚硝胺处理组相比,细胞内ROS水平明显降低（P<0.05）,表明NAC/mito-TEMPO可有效清除亚硝胺染毒引起的ROS的产生。NAC和亚硝胺共处理组、mito-TEMPO和亚硝胺共处理组与亚硝胺处理组相比,红色荧光强度相比明显减弱,细胞内mt ROS水平明显降低（P<0.05）,表明NAC/mito-TEMPO可有效清除亚硝胺染毒引起的mt ROS的产生。NAC和亚硝胺共处理组、mito-TEMPO和亚硝胺共处理组与亚硝胺处理组相比,绿色荧光强度明显减弱,红色荧光强度明显减弱,细胞内线粒体膜电位水平升高（P<0.05）,表明NAC/mito-TEMPO可有效抑制亚硝胺染毒引起的氧化损伤。（2）NAC和亚硝胺共处理组、mito-TEMPO和亚硝胺共处理组与亚硝胺处理组相比,NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β及IL-1β的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,表明活性氧,特别是线粒体活性氧介导亚硝胺诱导的NLRP3炎症小体活化。3.NLRP3炎症小体活化导致caspase-1依赖性细胞焦亡3.1亚硝胺致Het-1A细胞发生焦亡（1）PI染色结果显示,随着亚硝胺染毒浓度增加,PI染色的阳性细胞数逐渐增多。（2）Western blot检测结果显示:GSDMD的蛋白表达水平随着亚硝胺染毒浓度增加而升高（P<0.05）。结合细胞LDH释放检测结果、PI染色结果,表明亚硝胺可导致Het-1A细胞焦亡。3.2亚硝胺致Het-1A细胞发生焦亡的相关机制（1）与亚硝胺处理组相比,Z-YVAD-FMK和亚硝胺共处理组LDH释放量明显减少,细胞PI染色阳性比例下降,并且GSDMD、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β及IL-1β的蛋白表达水平也明显降低（P<0.05）。说明抑制caspase-1的活化能有效抑制NLRP3炎症小体活化及亚硝胺诱导的Het-1A细胞焦亡。（2）在NLRP3低表达的细胞内,亚硝胺诱导的LDH释放量明显减少（P<0.05）,细胞PI染色阳性比例下降;GSDMD、caspase-1、pro-caspase-1、pro-IL-1β及IL-1β的蛋白表达水平亦明显降低（P<0.05）。说明抑制NLRP3炎症小体活化可抑制亚硝胺诱导的细胞焦亡。结论:1.亚硝胺染毒导致食管上皮Het-1A细胞NLRP3炎症小体活化。2.亚硝胺通过诱导食管上皮Het-1A细胞发生氧化损伤,ROS、mt ROS产生增加,进一步介导NLRP3炎症小体活化。3.亚硝胺染毒可导致食管上皮Het-1A细胞焦亡,NLRP3/caspase-1/GSDMD通路与亚硝胺诱导的细胞焦亡发生相关。