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目的:骨质疏松症是一种多病因的增龄性病变,随着老龄化社会的到来越来越受到人们的重视。它的基本病理机制是骨代谢过程中破骨细胞（osteoclast,OC）骨吸收增加与成骨细胞（osteoblast,OB）骨形成减少,导致人体内的钙磷代谢不平衡,骨密度（Bone mineral density,BMD）逐渐减小而引起的。病因主要与年龄、内分泌紊乱、钙吸收不良以及免疫、营养等因素有关。雌激素替代疗法（estrogen replacement therapy,ERT）可以抑制骨质丢失,是目前临床防治绝经后妇女骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis,PMOP）的首选疗法。但长期使用可能增加子宫内膜癌及乳腺癌的发病几率。目前人们将寻找雌激素替代药物的目光放在了植物雌激素上。实验发现用含有一定浓度补骨脂注射液的DMEM培养成骨细胞有显著的促增殖作用,能影响骨的合成代谢,具有防治骨质疏松的作用。异补骨脂素是从补骨脂中提取的香豆素类化合物,属于植物雌激素的一种。本课题组前期研究的结果显示异补骨脂素对于促进大鼠成骨细胞增殖和提高碱性磷酸酶活性有较好的作用。锌,是维持机体正常生理功能和机体内环境正常生化代谢所必需的微量元素,也是骨代谢中的重要微量元素之一,可以有效刺激成骨细胞的骨形成和抑制破骨细胞的骨吸收作用。有研究显示微量元素锌可维持细胞周期的正常进行,促进细胞增殖分化;其对成骨细胞增殖及分化的原理可能是锌通过氨酰基转移核糖核酸合成酶刺激体外成骨细胞的蛋白质合成,从而促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖与分化。大量研究报道某些药物因素和营养因子可以防治骨质流失,目前我们对于有效化合物联合应用的了解还比较少。那么植物雌激素与营养因子结合是否对骨质疏松症有增效或协同作用呢?这在预防增龄性骨质流失可能有重要意义。目前已有研究证实大豆异黄酮加钙对绝经后大鼠的骨流失有预防作用,联合应用金雀异黄素和锌对大鼠股骨组织的骨成分有协同增效作用。异补骨脂素和锌结合对骨代谢有加强和/或协同效应的这种细胞机制尚未见报道,本研究即着眼于测定异补骨脂素与营养因子锌联合应用对成骨细胞的增殖与分化是否有协同增效的作用。实验采用体外培养成骨细胞的方法,观察异补骨脂素和锌对成骨细胞增殖与分化的影响。采用RT-PCR的技术,检测了异补骨脂素和锌对成骨细胞分泌的蛋白COLI mRNA,Smad4 mRNA,Runx2 mRNA,Osterix mRNA表达的影响。从细胞和分子水平来探讨异补骨脂素及其与锌配伍的补肾中药防治骨质疏松的机制,以期为提高骨质疏松症的临床疗效以及抗骨质疏松新药的开发提供实验依据。方法:1采用改良的组织块法分离培养新生（24 h内）SD大鼠颅骨成骨细胞。将不同浓度的异补骨脂素（10-8 mol/L10-9 mol/L）与锌（10-4 mol/L10-5 mol/L）加入到培养成骨细胞的培养基中,用倒置显微镜观察细胞形态和数量的改变。2采用噻唑蓝比色（MTT）法,以雌激素（estrogen, E2）为阳性对照,检测加药后,异补骨脂素和锌及其配伍组24 h,48 h,72 h对大鼠成骨细胞增殖的影响。3采用对硝基苯二钠基质动力学法（pNPP）法,以雌激素为阳性对照,检测了异补骨脂素和锌及其配伍组在24 h,48 h和72 h ,96 h对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响。4采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR,reverse transcriptase PCR）方法,以雌激素为阳性对照,检测含有异补骨脂素和锌培养基的大鼠成骨细胞在48 h时I型胶原（COL I） mRNA,Smad4 mRNA,Osterix mRNA,Runx2/Cbfa1 mRNA的基因表达。结果:1阳性对照雌激素对成骨细胞增殖与分化的影响1.1阳性对照雌激素组细胞形态学观察刚接种的成骨细胞成球形,悬浮于培养液中,逐渐沉降贴壁,24 h细胞贴壁展开。展开细胞形态不规则,呈多角形,培养72 h～96 h,细胞为长梭形、条索状,融合成片,分界较为模糊。培养96 h～120 h,细胞呈铺路石状态。如果再继续培养,细胞逐渐聚集形成细胞小结,随后胶原堆积,钙盐沉积,形成不透光的矿化结节。连续培养20代,可见细胞体积增大,胞质稀薄,细胞分裂速度下降等一系列细胞衰老的表现。雌激素组与空白对照组相比,在72 h～96 h时,细胞更加密集,细胞间隙少,形态无明显差异。1.2阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞在含有不同浓度雌激素培养基中培养24 h,在雌激素浓度为(10-5 mol/L,10-7 mol/L和10-8 mol /L)时有促大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）;培养48 h,在雌激素浓度为(10-6 mol/L, 10-8 mol/L和10-9) mol/L)有促大鼠成骨细胞增殖作用（P<0.05）;72 h,在雌激素浓度为(10-5 mol/L10-7 mol/L)与空白对照组相比有显著的促进大鼠成骨细胞增殖的作用（P<0.05）。1.3阳性对照雌激素组对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响培养48 h ,与空白对照组比较,雌激素组浓度为(10-5mol/L1×10-6 mol/L)有明显的促进碱性磷酸酶活性的作用（P<0.05）;培养72 h,雌激素浓度为(10-6 mol/L 1×10-9) mol/L)有促进碱性磷酸酶活性的作用（P <0.05）。2异补骨脂素、锌及其配伍组对成骨细胞增殖与分化及分泌的蛋白I型胶原（COL I） mRNA和TGF-β)1细胞信号转导因子Smad4 mRNA,核心结合因子1（Cbfa1） mRNA / Runx2 mRNA以及Osterix mRNA表达的影响。2.1异补骨脂素组、锌组、异补骨脂素加锌配伍组细胞形态学观察与雌激素组类似。2.2异补骨脂素和锌各配伍组对大鼠成骨细胞增殖的影响大鼠成骨细胞分别在含异补骨脂素、硫酸锌以及异补骨脂素加硫酸锌培养基中培养24 h,异补骨脂素(10-8 mol/L～10-9 mol/L)、异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)有促增殖作用;异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)与单纯异补骨脂素组或锌组相比增殖作用明显。培养48 h,异补骨脂素10-8 mol/L、异补骨脂素(10-8 mol/L)加硫酸锌(10-4 mol/L)、异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)与空白组比较有促增殖作用,其中异补骨脂素(10-8 mol/L)、异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5) mol/L)组的增殖作用更为显著。2.3异补骨脂素和锌各配伍组对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响大鼠成骨细胞在含异补骨脂素、硫酸锌以及异补骨脂素加硫酸锌培养基中培养48 h,异补骨脂(10-9 mol/L)、硫酸锌(10-4 mol/L)、异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)与空白组比较提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性,其中异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)的促分化作用更明显。培养72 h异补骨脂素(10-8和10-5 mol/L)、异补骨脂素(10-8 mol/L)加硫酸锌(10-4 mol/L)、异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)组有促进碱性磷酸酶活性的作用,异补骨脂素(10-9 mol/L)加硫酸锌(10-5 mol/L)对碱性磷酸酶活性的影响更加显著。2.4异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的I型胶原（COL I） mRNA表达的影响与空白对照组相比,能显著促进COL I mRNA的表达（P<0.01）;与雌激素组相比也有统计学意义,能明显提高COL I mRNA的相对表达量（P<0.01）。2.5异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Smad4 mRNA表达的影响异补骨脂素、异补骨脂素加锌和空白组相比明显促进转化生长因子的信号转导因子Smad4 mRNA的表达（P<0.01）。2.6异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Runx2/Cbfa1 mRNA表达的影响异补骨脂素加锌组能明显促进Runx2/Cbfa1 mRNA的表达（P<0.05）;其表达量高于单纯使用异补骨脂素组。2.7异补骨脂素加锌对大鼠成骨细胞分泌的Osterix mRNA表达的影响异补骨脂素组,异补骨脂素加锌组均能增强Osterix mRNA的表达（分别为P<0.05,P<0.01）,异补骨脂素加锌组表达量高于雌激素组和异补骨脂素组。结论:1一定浓度配伍的异补骨脂素加锌可以促进成骨细胞的增殖与分化。异补骨脂素、及其与锌的配伍组促进成骨细胞分泌蛋白I型胶原（COL I） mRNA的表达,上调Smad4 mRNA的表达,并且能够上调Runx2/Cbfa1mRNA和Osterix mRNA的表达,说明异补骨脂素及其配伍组可能通过促进骨形成途径来防治骨质疏松。2植物雌激素异补骨脂素很可能是补肾中药补骨脂发挥补肾壮骨作用的物质基础之一。3说明异补骨脂素加锌有可能是通过促进细胞分泌I型胶原（COL I）,Smad4,Runx2/Cbfa1和Osterix蛋白来发挥其促进骨形成作用。4研究异补骨脂素和锌配伍对骨质疏松的防治作用为抗骨松的药物开发和临床用药提供了实验依据。