背景和目的骨组织是一个活跃的、动态的组织,在营养、激素、机械等刺激下不断更新。成骨细胞是一种间充质来源的细胞,它在骨组织形成和维持骨稳态过程中发挥着非常重要的作用。一方面,成骨细胞参与骨组织的构成,维持骨结构的完整,能够合成和分泌多种成骨相关蛋白,形成细胞外基质,调节骨的矿化;另一方面,成骨细胞能够分泌多种细胞因子或者通过细胞间直接接触调节破骨细胞的分化及活性。成骨细胞功能的异常参与了人类多种以骨改建异常为主要表现的疾病的病理过程。因此,研究病理状态对成骨细胞的影响对于疾病的预防和治疗具有十分重要的意义。牙周炎是临床上常见的一种以牙菌斑为始动因子的慢性、细菌感染性、炎症性疾病,它的特征病理改变之一是牙槽骨吸收。牙周致病菌入侵后将引发机体中一系列炎症介质的表达,激活宿主的免疫炎性反应过程,产生多种促炎细胞因子。促炎细胞因子TNF-α已被证实是牙周炎病理过程中的关键因子,它具有多种生物学活性。TNF-α对破骨分化的促进作用较为明确,但是,TNF-α对成骨分化的作用尚存在很大争议。现有的研究结果显示TNF-α能够抑制体外培养的间充质细胞、成骨细胞的成骨分化,体内实验也证实TNF-α对骨形成有抑制作用。但有学者发现TNF-α能够促进骨髓间充质细胞(BMSCs)、成骨细胞、牙髓干细胞(DPSCs)的成骨分化。TNF-α与其受体结合后能够激活多条通路,这些信号通路相互作用、相互制衡,共同调节成骨分化。在牙周炎的发展过程中,炎症过程的持续时间和作用强度差别较大,而TNF-α等炎性介质的水平不断起伏变化,牙槽骨破坏的静止期和活动期交替进行。骨折对骨改建也有很大影响,但是值得注意的是,在骨折愈合过程中,TNF-α作为一种非常重要的促炎细胞因子参与了骨再生的过程,对骨折愈合起重要的促进作用。因此明确不同强度的炎症环境对成骨分化的影响及其生物学基础,对于进一步了解炎症过程的分子生物学机制并指导开发新的牙周病治疗手段尤为重要。NF-κB信号通路已被证实是TNF-α下游的关键信号之一。TNF-αα与其受体结合后能够通过一系列反应激活细胞内NF-κB信号,从而调节靶基因的转录。研究发现,应用NF-κB的拮抗剂阻断TNF-α对NF-κB信号的活化作用后,TNF-αα对MC3T3-E1细胞的成骨分化的抑制作用被逆转;在ST2的成骨分化过程中,TNF-α活化的NF-κB信号通路通过抑制Runx2基因的表达对ST2细胞的成骨分化发挥抑制作用。因此,细胞内活化的NF-κB信号与TNF-α介导的成骨分化抑制作用密切相关。EphrinB2-EphB4信号通路是近年来发现的骨改建过程中的一条重要的新通路。EphrinB2与EphB4结合后逆向信号通过ephrinB2配体传入破骨细胞前体细胞,抑制其破骨分化;正向信号通过EphB4受体传入成骨细胞,促进成骨分化。因此,ephrinB2-EphB4信号在促进骨形成的同时抑制了过度的骨吸收,在维持骨稳态中发挥至关重要的作用。炎症过程是一种多因素参与的过程,炎症微环境可以导致骨改建相关信号的变化。因此,炎症刺激有可能通过ephrinB2-EphB4正向信号影响成骨细胞分化。本实验采用不同浓度TNF-α作为不同强度炎症刺激,探讨不同浓度TNF-α刺激对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响,并探讨ephrinB2-EphB4正向信号在这个过程中的作用;同时,还观察了阻断NF-κB信号通路对成骨细胞分化及EphB4表达的影响,初步探讨TNF-α调控ephrinB2-EphB4正向信号的分子生物学机制,以期更加深入了解炎症刺激对成骨细胞分化的影响及其分子生物学机制,为开发牙周病治疗方法提供新思路。材料和方法1.TNF-α对MC3T3-E1细胞成骨分化影响的研究复苏液氮中冻存的MC3T3-E1细胞,传代2次后,取生长状态良好的细胞用于实验。RT-PCR检测不同浓度TNF-α对MC3T3-E1细胞Runx2和BSP mRNA表达的影响;Western blot检测不同浓度TNF-α对MC3T3-E1细胞Runx2和BSP蛋白表达的影响;应用碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒检测不同浓度TNF-α处理后MC3T3-E1细胞ALP活性;茜素红染色法检测不同浓度TNF-α处理对MC3T3-E1细胞形成矿化结节的影响并且应用十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后酶标仪检测溶液吸光度值从而对细胞内钙含量进行半定量分析。2.TNF-α调控MC3T3-E1细胞成骨分化的信号通路研究RT-PCR检测不同浓度的TNF-α对MC3T3-E1细胞内EphB4 mRNA表达的影响;Western blot检测不同浓度TNF-α处理后MC3T3-E1细胞内EphB4蛋白表达水平。构建携带EphB4 siRNA的慢病毒载体,用脂质体法包装携带EphB4 siRNA的慢病毒。慢病毒感染MC3T3-E1细胞建立EphB4基因干扰的MC3T3-E1细胞模型后分别应用RT-PCR和Western blot检测细胞内EphB4 mRNA和蛋白的表达水平。MC3T3-E1细胞内EphB4被干扰后应用TNF-α处理,Western blot检测细胞成骨相关基因Runx2和BSP蛋白表达水平;碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒检测TNF-α对细胞ALP活性的影响;茜素红染色法检测TNF-α对细胞形成矿化结节的影响并且应用十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后酶标仪检测溶液吸光度值从而对细胞内钙含量进行半定量分析。用ephrinB2-fc 激活 MC3T3-E1 细胞内 ephrinB2-EphB4 正向信号后,Western blot检测TNF-α对Runx2和BSP蛋白表达水平的影响;碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒检测TNF-α对细胞ALP活性的影响;茜素红染色法检测TNF-α处理对MC3T3-E1细胞形成矿化结节的影响并且应用十六烷基氯化吡啶将钙离子析出后酶标仪检测溶液吸光度值从而对细胞内钙含量进行半定量分析。3.TNF-α调控成骨细胞内ephrinB2-EphB4正向信号的分子生物学机制初步研究Western blot 检测 TNF-α 对 MC3T3-E1 细胞 NF-κB 信号的影响;用 NF-κB抑制剂PDTC处理MC3T3-E1细胞,Western blot检测TNF-α对细胞p-NF-κB p65、Runx2、BSP及EphB4蛋白表达的影响。结果1.TNF-α对MC3T3-E1细胞成骨分化影响与对照组(0ng/mlTNF-α)相比,TNF-α处理24、48小时后,MC3T3-E1细胞内Runx2和BSP mRNA和蛋白表达在低浓度(0.1和1 ng/ml)时升高,在高浓度(10ng/ml)时明显降低;TNF-α刺激7、14天后,MC3T3-E1细胞ALP活性在低浓度(0.1和1ng/ml)时明显升高,在高浓度(10ng/ml)明显降低;TNF-αα处理28天后,细胞形成矿化结节量在低浓度(0.1和1ng/ml)时增多,在高浓度(10ng/ml)时明显减少,同时,钙含量检测结果显示MC3T3-E1细胞钙含量在低浓度(0.1和1ng/ml)明显升高,在高浓度(10ng/ml)时明显减低。2.ephrinB2-EphB4正向信号在TNF-α调控成骨分化中的作用(1)低浓度(0.1 和 1ng/ml)TNF-α 处理 24、48 小时后,MC3T3-E1 细胞 EphB4的mRNA和蛋白表达水平与对照组(0ng/mlTNF-α)相比明显升高,高浓度(10 ng/ml)TNF-α处理24、48小时后,MC3T3-E1细胞EphB4的mRNA表达水平与对照组(0 ng/ml TNF-α)相比明显降低。(2)慢病毒感染MC3T3-E1细胞后,ephrinB2-EphB4正向信号被干扰,结果显示与阴性对照病毒感染组相比,干扰组MC3T3-E1细胞的EphB4 mRNA及蛋白表达均明显降低。(3)与对照组相比,低浓度TNF-α对MC3T3-E1细胞内Runx2和BSP蛋白表达、ALP活性和矿化结节的形成有明显促进作用。干扰ephrinB2-EphB4正向信号逆转了低浓度TNF-α对MC3T3-E1细胞上述成骨分化相关指标的促进作用。(4)与对照组相比,高浓度TNF-α对MC3T3-E1细胞内Runx2和BSP蛋白表达、ALP活性和矿化结节的形成有明显抑制作用。同时应用ephrinB2-fc和TNF-αα处理MC3T3-E1细胞后,Runx2和BSP蛋白表达、ALP活性和形成的矿化结节数量与单独应用TNF-α处理组相比明显升高。3.TNF-α调控成骨细胞内ephrinB2-EphB4正向信号的分子生物学机制(1)应用10 ng/ml TNF-α处理MC3T3-E1细胞后,细胞内p-NF-κB p65水平较未处理组明显升高;MC3T3-E1细胞经PDTC预处理后加入TNF-α处理,细胞内p-NF-κB p65水平较单纯TNF-α处理组明显降低。(2)与对照组(0ng/mlTNF-α)相比,10ng/mlTNF-α 处理 24、48 小时后 MC3T3-E1细胞Runx2和BSP蛋白表达明显降低;MC3T3-E1细胞经PDTC预处理后加入TNF-α处理,Runx2和BSP蛋白表达较单纯TNF-α处理组明显升高。(3)与对照组(0ng/mlTNF-α)相比,TNF-α处理24、48小时后MC3T3-E1细胞EphB4蛋白的表达降低。PDTC预处理后加入TNF-α处理,MC3T3-E1细胞内EphB4表达较单独应用TNF-α处理组明显升高。结论1.不同浓度TNF-α对成骨细胞分化的影响不同,低浓度的TNF-α促进成骨细胞分化,而高浓度的TNF-α抑制成骨细胞分化。2.ephrinB2-EphB4正向信号被干扰后,逆转了低浓度的TNF-α对成骨细胞分化的促进作用;应用ephrinB2-fc后,高浓度的TNF-α处理的成骨细胞的成骨分化相关指标与单独应用TNF-α处理组相比明显升高。结果提示TNF-α对成骨细胞分化的影响是通过ephrinB2-EphB4正向信号介导的。3.NF-κB信号的抑制剂阻断了高浓度的TNF-α对成骨细胞分化和对EphB4表达的抑制作用,提示高浓度的TNF-α可能通过活化NF-κB信号来调控成骨细胞内ephrinB2-EphB4 正向信号。