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2018年全国龟类养殖总量47676吨,比2017年增长4.10%;全国淡水养殖鱼类2544万吨,其中罗非鱼养殖产量为162万吨,占比6.4%。近年来,水产养殖行业集约化提高,疫病尤其是细菌性疾病成为制约行业发展的主要问题之一。肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）和迟缓爱德华氏（Edwardsiella tarda）是龟类常见细菌病原。罗非鱼的迟缓爱德华氏菌病和无乳链球菌病是两大暴发性疾病。以上三种细菌均为人畜共患菌,不仅影响养殖业的持续发展,也对人类的生命健康造成威胁。龟鳖疫苗研制相对滞后,龟肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌的疫苗仍处于空白,罗非鱼的无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌已有较多学者进行研究,但目前细胞水平的研究相对较少,因此,本文开展了以下工作:1、对发病中华草龟（Chinemys reevesii）分离的S27和S28致病菌通过分离纯化、生长特性鉴定、生化实验、分子生物学实验进行鉴定,并分别测定半数致死量(LD50),选取23种药物对分离菌株进行药敏实验。结果显示,S27和S28分别鉴定为肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌,对中华花龟的半数致死量分别为3×107CFU/m L和2.4×106CFU/m L。药敏实验中,肺炎克雷伯菌仅对头孢吡肟高度敏感,对氨曲南,四环素中度敏感,对氟苯尼考,阿莫西林等20种抗生素不敏感,耐药性极强。迟缓爱德华氏菌对头孢吡肟,氨曲南,恩诺沙星,氟苯尼考等高度敏感,对新霉素、阿奇霉素、氯霉素等中度敏感,对阿莫西林、头孢氨苄等不敏感。2、探索肺炎克雷伯菌和迟缓爱德华氏菌的灭活苗制作条件,采用最佳灭活条件灭活。安全性检测合格后,分别对70只花龟通过腹腔注射进行首次免疫,14d后对其中的40只进行二次免疫。实验42d,期间每7d随机选择5只龟颈静脉窦采血,分离血清,对血清中的溶菌酶活性、C3补体活性、血清抗体效价进行测定。于首次免疫和二次免疫后的14d取20只以5LD50的活菌浓度攻毒,计算死亡率及免疫保护率。结果显示:灭活苗的最佳制作条件为0.03%甲醛浓度,30℃,48h灭活。溶菌酶活性均在第35d达到峰值,且明显高于对照组。肺炎克雷伯菌实验组的C3补体在28d表达量最高,肺炎克雷伯菌组在两次免疫后的第14d抗体效价均增高,为4log2和6log2,但维持时间较短,下降速度快,免疫保护率为28%和50%;迟缓爱德华氏菌实验组C3补体在35d到达峰值,迟缓爱德华氏菌首次免疫的第14d抗体效价为6log2,二次免疫后,抗体应答较为强烈,持续上升,在第42d上升为10log2,且暂未见下降趋势,免疫保护率为60%和73%。3、利用组织块贴壁法,选用含有2%双抗、20%FBS的M199培养基,成功培养出龟心脏、肝脏、脾脏原代细胞。心脏与脾脏7d开始有细胞迁出,肝脏组织细胞10d左右开始迁出,心脏、肝脏、脾脏细胞分别在第35d、40d、50d单层达到培养瓶底面积80%以上。心脏细胞多呈三角形,肝脏细胞多为多边形,脾脏细胞以长条形为主,均为成纤维细胞。心脏和肝脏细胞传至第六代,因优势细胞体型大、扁平多边、生长缓慢最终凋亡,脾脏细胞在正常生长条件下出现脱落,传至第八代全部脱落。4、通过常温胰蛋白酶消化法建立罗非鱼脑细胞系,筛选最适生长条件,对细胞冻存复苏存活率进行统计。用无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌对第30代细胞进行分时段刺激,探究革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌刺激下罗非鱼脑细胞免疫因子的调控。结果显示,胰酶消化后的罗非鱼脑细胞单细胞悬液接种培养瓶7d后开始有细胞附着,30d左右长满瓶底可进行传代,目前已传至40代,第5代细胞冻存2个月后细胞复苏存活率约为75%。细胞生长最适培养基为M99培养基,最适生长温度为28℃,最适血清浓度为15%。两种细菌均抑制细胞中My D88的表达,对NF-κB的表达表现为先抑制后诱导,诱导IL-1?和TNF-α的表达。其中革兰氏阴性菌迟缓爱德华氏菌对IL-1?的诱导作用大于革兰氏阳性菌无乳链球菌,而对TNF-α的诱导作用则无乳链球菌素明显强于迟缓爱德华氏菌。