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目的构建能够高效表达mi R-508-5p小分子的慢病毒载体,探讨其对恶性肿瘤细胞生长进程的影响,为临床恶性肿瘤治疗提供新的生物学标志物和分子靶标。方法1.收集宁夏医科大学总医院病理科中低分化胃腺癌病人福尔马林固定后石蜡包埋的组织(FFPE)12例和癌旁组织(FFPE)10例,采用q RT-PCR方法检测FFPE组织中mi R-508-5p表达水平,采用免疫组化法检测胃腺癌组织(HCC)中SKP2蛋白表达水平,收集临床数据,证实芯片数据。2.参照mi RBase数据库人源hsa-mi R-508-5P基因序列(MIMAT0004778),设计一对寡核苷酸链,退火后能形成含有茎环结构的mi RNA前体序列,并在序列两端分别加上Hpa 1和Xho 1酶切位点;将线性化的p Sico R质粒与双链mi R-508-5p DNA片段连接,大量克隆后经双酶切及测序鉴定。3.按照Trans Lipid Transfection Reagent脂质体转染试剂,将三质粒系统(p Sico R/mi R-508-5p过表达载体1.5μg,p VSVG 0.45μg,△8.91 1.05μg)共转染至HEK-293T细胞中,包装慢病毒并且按照倍比稀释原则测定病毒滴度。4.运用mi Randa、Targetscan和Pic Tar等靶基因预测软件检索mi R-508-5p潜在的靶基因,筛选出保守程度高、结合自由能低,并且与癌症相关的基因作为候选靶基因,通过预测,我们选定MAPK1、Skp2为研究的靶基因,然后构建萤火虫荧光素酶表达载体,在293T细胞中验证mi R-508-5p与两者之间的靶向关系。将MAPK1、Skp2的3’UTR和突变体亚克隆至p MIR-Report质粒荧光素酶报告基因下游,使之能表达融合靶基因3’UTR的重组荧光素酶,将p MIR-Report/MAPK1、p MIR-Report/Skp2重组质粒和p Sico R/mi R-508-5p表达质粒通过脂质体转染方法转染293T细胞,48h后收集细胞,采用双荧光素酶报告基因系统,以海肾荧光素酶作为参照,进行荧光素酶检测。同时共转染靶基因突变体,验证敲除其作用位点是否具有靶向关系。5.用制备的p Sico R/mi R-508-5p慢病毒和p Sico R/NC空病毒感染肿瘤细胞,包括Hep G2、SGC7901、Hela和SW480细胞,感染48h后,收集细胞,分别提取micro RNAs和总蛋白,通过RT-PCR、q RT-PCR和Western Blot分别检测mi R-508-5p和Skp2表达水平。6.用p Sico R/mi R-508-5p慢病毒和p Sico R/NC空病毒感染肿瘤细胞,分别于24、48、72 h后终止刺激,采用MTT法检测细胞的增殖水平,Hochest染色检测细胞的凋亡水平,细胞划痕实验检测细胞水平迁移与细胞愈合能力,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭实验,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果1.通过q RT-PCR检测发现mi R-508-5p在中低分化胃腺癌组织中表达水平相较于在正常胃粘膜中表达水平明显下调,并且随着病理分级越严重,表达量成逐级下调的正相关趋势,q RT-PCR检测结果和芯片数据结果一致;免疫组化法显示Skp2蛋白在中低分化胃腺癌中明显高表达,而在正常胃粘膜中Skp2蛋白几乎不表达。2.成功构建p Sico R/mi R-508-5p慢病毒载体和高滴度的重组慢病毒,通过Real-Time PCR检测显示,表明重组慢病毒可有效促进内源mi R-508-5p小分子表达。3.生物信息学分析结果显示mi R-508-5p和MAPK1、Skp2存在可能的结合位点,且通过双荧光素酶报告基因系统和Western blot证实,mi R-508-5p可以靶向调控MAPK1、Skp2并且抑制其蛋白的表达水平。4.慢病毒侵染肿瘤细胞模型证实:慢病毒颗粒能够明显促进mi R-508-5p(P<0.05)在各肿瘤细胞株的表达水平;相反,mi R-508-5p过表达能够明显抑制Skp2 m RNA(P<0.05)和/或其蛋白表达水平;而转染了mi R-508-5p/inhibitor组,Skp2 m RNA(P<0.05)和蛋白表达水平又有所升高。以上实验表明mi R-508-5p与SKP2基因具有特异性靶向关系。5.细胞模型中,p Sico R/mi R-508-5p感染细胞组:MTT检测发现其能有效抑制细胞增殖水平;Hoechst染色发现其感染组细胞染色质浓集的细胞核较正常对照组明显增多,发生明显的中晚期细胞凋亡;细胞划痕实验发现感染组能有效抑制肿瘤细胞的水平迁移运动;Transwell实验发现感染组细胞明显抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力。6.采用流式细胞术检测探究mi R-508-5p对肿瘤细胞调控的作用机制,发现p Sico R/mi R-508-5p感染组细胞早期凋亡和晚期凋亡细胞明显增高,单倍体G0/G1期细胞百分率明显高,而处于双倍体G2/M期细胞百分率相应下降。表明mi R-508-5p抑制细胞向G2/M期分裂期发展分化,遏制细胞停留在非分裂期G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞恶性增殖。结论成功构建与制备p Sico R-mi R-508-5p慢病毒,有效提高mi R-508-5p小分子的表达,负向调节MAPK1、Skp2基因的表达;肿瘤细胞模型进一步证实mi R-508-5p高表达有效调控胃腺癌等肿瘤细胞代谢活动,将成为有潜力的肿瘤治疗分子靶标,为抗肿瘤药物研发提供新的方向。