鸭瘟病毒强毒株AV1221株gH基因的克隆与截短型gH基因的原核表达

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根据GenBank中已发表鸭瘟病毒弱毒株序列,设计合成3条引物。将鸭瘟强毒AV1221株100倍稀释,接种12日龄鸭胚绒毛尿囊腔,增殖病毒。以病毒DNA为模板,用PCR方法,扩增gH基因片段,并用巢式PCR进行目的DNA的筛选。将扩增得到的基因克隆到pMD18-T载体上,经蓝白斑筛选和PCR鉴定筛选出阳性克隆进行序列测定,用生物学软件将所测序列进行分析,然后将其与参考序列进行比较。结果显示:鸭瘟病毒AV1221株gH基因全长为2505bp,编码834个氨基酸,gH基因是一个完整的开放阅读框。与参考序列比较,核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.3%。上述结果表明,gH基因在不同毒株间高度保守。   用生物学软件分析蛋白gH的抗原性,选取其中一段抗原性较好的区域,命名为gH1,重新设计一对引物,引物两端有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,采用PCR方法克隆该片段。将所得的片段插入pMAL-2x载体,构建重组质粒,重组质粒经PCR和酶切鉴定为阳性后,转化入宿主菌TB1。IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析表明,在64.4KD处出现了与预期大小相符的目的条带。对表达蛋白做可溶性分析,证实该蛋白主要以包涵体形式存在。
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