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纳米技术在共递送化疗药物和基因治疗恶性肿瘤中显示良好的应用前景,改善了药物递送过程中稳定性低、溶解度小、选择性差等问题。然而有效推动共递送基因和化疗药物纳米载体走向临床仍需不断努力。pH敏感共递送药物和基因纳米载体以其可控释药的优势成为近年研究热点。pH敏感共递送抗癌药和基因纳米载体可简单利用肿瘤微环境和内吞体/溶酶体酸性环境实现药物和基因可控递送,从而降低毒副作用并提高治疗效果。肿瘤微环境pH敏感共递送化疗药物和基因纳米载体在血液循环中稳定存在,到达酸性肿瘤组织后,外壳pH敏感性脱落,暴露功能化内核并被肿瘤细胞摄取,增加胞内有效药物浓度,提高抗肿瘤效果；内吞体/溶酶体pH敏感纳米载体进入细胞内吞体/溶酶体后,在酸性pH诱导下可迅速释放药物,到达胞内可控释药目的。然而,随着研究不断深入,更为精确控制药物释放以及增加胞内有效药物浓度问题受到广泛关注。利用肿瘤微环境pH(6.0～7.0)低于正常组织pH(7.4),内吞体/溶酶体pH(4.5～6.5)低于胞浆pH(7.4),设计一种在肿瘤微环境和溶酶体/内吞体酸性环境中程序性响应地双pH敏感共递送药物和基因纳米载体可实现药物和基因更为精确控制释放并增加胞内有效药物浓度。本课题采用功能集成组装技术构建肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体,以期实现化疗药物和基因更为可控地递送。选取目前最为有效的聚阳离子基因载体聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)作为内核材料共递送化疗药物DOX和基因。采用内吞体/溶酶体pH响应性裂解腙键连接DOX和PEI,合成了胞内pH敏感载药材料DOX-PEI (DP)。O-羧甲基壳聚糖(O-carboxymethyl-chitosan, CMCS)生物相容性良好,且CMCS在pH高于7.0时荷负电而在pH低于6.5时荷正电。基于此,合成了以NGR为靶向因子的肿瘤微环境pH敏感材料CMCS-PEG-NGR(CPN)。基于以上功能化DP和CPN,可组装肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体CPN/DP/pDNA (CPN/DPD, CDPD)。DP作为一种阳离子聚合物,可有效压缩荷负电的pDNA分子形成DP/pDNA复合物(DPD),实现药物和基因的共同装载。制备的内吞体/溶酶体pH敏感共递送DOX和pDNA纳米载药DPD, DPD内核表面带正电荷,在生理条件下(pH 7.4)吸附荷负电CPN,形成肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体CPN/DPD (CDPD)。 CDPD经给药后将在血液循环中稳定存在,到达肿瘤部位后,NGR介导转胞吞作用在肿瘤组织蓄积。肿瘤微环境pH诱导CPN由负电荷逆转为正电荷并从CDPD表面脱落(第一重pH敏感),暴露DPD内核。DPD表面正电荷可有效促进细胞摄取作用,进入肿瘤细胞的DPD输送到内吞体/溶酶体,经内吞体/溶酶体酸性pH诱导,腙键断裂并迅速释放DOX(第二重pH敏感),由于PEI“质子海绵”效应产生溶酶体逃逸作用,PEI/pDNA和DOX释放进入胞浆,并发挥相应抗肿瘤作用。实验中以编码绿色荧光蛋白的pDNA为模型基因,考察CDPD在模拟肿瘤微环境pH和内吞体/溶酶体pH条件下CPN响应性脱落以及DOX和pDNA程序释放。探究CDPD作为肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体可能性,为进一步抗肿瘤研究奠定基础。为进一步探究肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体优势并提高胞内有效药物和基因浓度,提高癌症治疗效果。利用TAT肽作为一种经典阳离子细胞穿透肽,以PEG共同连接TAT和PEI,合成了具有促进穿细胞膜作用材料PEI-PEG-TAT (PPT)。同时选定肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体质粒(plasmid tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands, pTRAIL)为治疗基因。采用DP和PPT掺和压缩制备胞内pH敏感的促细胞摄取PPT/DP/pTRAIL (PDT),制备的PDT内核包裹CPN后形成肿瘤组织和肿瘤细胞双促进的肿瘤微环境和内吞体／溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体CPN/PDT (CPDT)。以期待制备的CPDT除具有肿瘤微环境和内吞体／溶酶体双pH敏感特性实现更为可控药物和基因释放外,到达肿瘤组织后由于NGR介导转胞吞作用在肿瘤部位蓄积(第一重促进作用),肿瘤组织pH诱导CPN脱落后暴露的PDT内核由于TAT介导穿细胞膜(第二重促进作用),增加胞内有效药物和基因浓度。实验过程中对PPT促进细胞摄取PDT能力进行考察并确定最优处方,对PDT体外抗增殖作用进行考察,同时采用Western Blot分析TRAIL蛋白表达。为双pH敏感共递送载体进一步应用奠定基础。综上所述,本课题主要研究肿瘤微环境和内吞体／溶酶体双pH敏感纳米载体作为共递送载体可能性以及肿瘤微环境和内吞体／溶酶体双pH敏感纳米载体共递送化疗药物DOX和治疗基因pTRAIL体外抗肿瘤效果。为肿瘤微环境和内吞体／溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体进一步应用奠定基础,本课题主要研究方法和结果如下：1 DOX含量测定方法学考察采用紫外分光光度法测定DOX在pH 5.0和pH 7.4的PBS中含量,并对方法学进行研究。结果表明此方法简便快速且专属性好,在pH 5.0和pH 7.4的PBS中,DOX浓度在0.05-100μg/mL范围内与吸光度(A)呈良好线性关系。精密度和回收率均符合规定。2双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体构建和评价功能化材料的合成是肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体构建的基础。本课题合成DP和CPN,核磁图谱验证结构。基于功能化DP和CPN,采用功能集成组装技术构建胞内pH敏感DPD和肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感CDPDo选定DP/pDNA最优质量比为25：4制备DPD,同时选定CPN/pDNA最优质量比为25：8制备CDPD。DPD和CDPD外观形态圆整,呈球形和类球形。DPD和CDPD平均粒径分别为80.0±4.2 nm和137.4±2.7 nm,Zeta电位分别为23.59±2.59 mV和8.25±2.43 mV。体外稳定性实验结果表明,在储存条件下DPD比CDPD纳米粒稳定性好,DPD和CDPD纳米粒在4℃条件下储存一周后平均粒径分别增加了约33.35 nm和83.02 nm,在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中CDPD比DPD稳定性好,DPD和CDPD在37℃与含10% FBS的DMEM孵育24 h后平均粒径分别增加了约226.48 nm和36.6 nm。体外摄取实验结果表明,CDPD纳米在CD13阳性A549中摄取率(92.49±2.28%)要高于其在CD13阴性HepG2细胞中摄取率(67.82±0.07%,p<0.05)。不同pH条件下体外转染实验结果发现,pH值从7.4降低到6.0,CDPD在HepG2细胞上转染效率逐渐增高,表明在模拟肿瘤微环境pH条件下(pH 6.0),CPN可从CDPD纳米粒表面完全脱落。脱落CPN外壳的DPD内核在模拟内吞体/溶酶体环境中(0.1 M的pH 5.0 PBS)孵育4h后,可完全释放DOX并保护pDNA免受破坏。共递送实验结果表明,CDPD到达肿瘤部位后暴露DPD内核并有效共递送DOX和pDNA进细胞。3双促进双pH敏感共递送DOX和pTRAIL纳米载体的构建和评价为进一步验证肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和基因纳米载体优势,并提高胞内有效药物浓度,杀死肿瘤细胞。合成了促进穿细胞膜PPT,并选定pTRAIL为治疗基因。采用DP和PPT掺和压缩pTRAIL制备肿瘤组织和肿瘤细胞双促进的肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感共递送DOX和pTRAIL纳米载体内核PPT/DP/pTRAIL(PDT)。琼脂糖凝胶电泳实验结果表明,PPT. DP和C6-SANH-PEI材料具有相似的压缩基因能力,均能够在质量比为25：16时将pTRAIL完全压缩。选定最优处方为混合材料与pTRAIL质量比为25：4,混合材料中PPT占30%。制备的PDT外观圆整,呈类球形,平均粒径为80.29±3.66 nm。与游离DOX以及只载pTRAIL纳米载体(PPT/C6-S ANH-PEI/pTRAIL, PCT)比较,PDT能够显著提高在HepG2和A549细胞上的体外抗肿瘤效果。同时Western Blot分析实验结果显示,PDT能够很好地转染HepG2细胞,提高蛋白表达量。因此制备的双促进双pH敏感共递送DOX和pTRAIL纳米载体CPN/PDT (CPDT)具备肿瘤细胞内外双重敏感的同时,也具肿瘤部位和肿瘤细胞双重促进作用,因此CPDT除以一种更为可控的方式释放药物和基因,还可有效增加胞内药物浓度,提高抗肿瘤效果。综上,本课题构建的肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感CDPD实现肿瘤细胞内外双重pH敏感,以一种更为可控的方式释放DOX和基因。为验证肿瘤微环境和内吞体/溶酶体双pH敏感纳米载体的优势并提高胞内药物浓度,制备的双促进双pH敏感CPDT在具备肿瘤细胞内外pH敏感的同时,还可发挥双重促进作用,提高有效胞内药物浓度,并发挥抗肿瘤作用,为恶性肿瘤治疗提供了一种新思路、新方法。